结直肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，位居欧美发达国家和地区恶性肿瘤发病和死因的第二和第三。近二十余年来，随着我国居民生活方式和膳食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈上升趋势。目前，结直肠癌的手术疗效已有所改观，而复发和转移是临床医师面临的主要难题。在分期较早的病人中，可能存在未被常规病理形态学或临床检查所发现的微转移。因此，从分子水平对结直肠癌转移早期发现和诊断是提高术后生存率的关键所在。 本研究针对石蜡包埋组织RNA的提取方法进行了研发，并建立了一种可应用于临床的提取方法；针对RNA定量的需要，建立了可直接用于RT—PCR的定量参考品；采用TaqMan实时荧光定量RT—PCR(qRT—PCR)方法对鸟苷酸环化酶C(guanylyl cyclase C，GCC) mRNA在结直肠癌组织、配对正常粘膜及淋巴结中的表达水平进行检测，分析GCC基因mRNA在结直肠癌中的表达情况，建立了一种可以用于结直肠癌转移的早期标记物检测方法。 第一部分石蜡包埋组织中总RNA的提取和纯化 目的：建立一种从福尔马林固定、石蜡包埋组织提取和纯化总RNA的简便、快速的方法。 方法：从广州达安临床检验中心病理科收集石蜡包埋标本20例，其中2008年新鲜包埋的标本有6例，2006年和2007年包埋标本各5例，2005年包埋标本7例，这些标本涉及到了子宫肌瘤，阑尾炎，大肠癌，胰腺炎，肝癌等。每例标本均切取5张10μm厚切片，运用硅胶模—离心柱法从石蜡包埋组织中提取RNA，以经典的AGPC(酸—异硫氰酸胍—苯酚—氯仿法，acid guanidium thiocyanate—phenol chloroform extraction，AGPC)法做对照。提取总RNA经紫外分光光度计测定纯度，琼脂糖凝胶电泳和管家基因TBP检测所提RNA的质量。 结果：20例石蜡包埋组织中提取的总RNA经过紫外分光光度仪测定后，260nm与280nm光密度比在1.8～2.0；经琼脂糖凝胶电泳分析，部分样本可以看到预期的目的条带。经过荧光定量RT—PCR检测，所有样本提取的RNA都能扩增出TBP片段。 结论：硅胶模—离心柱法提取石蜡包埋组织中的RNA简便、经济、快速，可用于临床研究。 第二部分 GCC定量标准品的制备 目的：应用体外转录的方法，制备定量GCC mRNA的标准品，用于荧光定量RT—PCR检测。 方法：提取结直肠癌组织总RNA，RT—PCR扩增后用PMD-18T载体连接构建重组质粒，应用体外转录的方法，即用带有T7启动子序列和PolyT序列的引物对目的基因和内参照进行PCR，克隆入PMD-18T载体进行体外合成GCC和TBP的cRNA模板。合成的cRNA定量和稀释后，进行逆转录和实时PCR，即可得到cRNA标准曲线。 结果：cRNA定量的线性范围达5个数量级，相关系数为0.99。 结论：成功制备了定量GCC的标准品，可应用于荧光定量RT—PCR定量检测。 第三部分 GCC在转移性结直肠癌中的表达研究 目的：研究鸟苷酸环化酶C(GCC mRNA)在结直肠癌中的表达并探讨其意义。 方法：提取57例结直肠癌肿瘤组织、癌旁正常组织以及癌旁淋巴结中总mRNA，应用荧光定量RT—PCR的方法检测GCC表达情况。利用第二部分构建的标准品采用绝对定量的方法分析结果，最后应用SPSS统计学软件进行分析。 结果： 1.GCC在正常结直肠组织及结直肠癌组织中均有表达，但在结直肠癌组织中的表达明显较正常结直肠组织中的表达强(P<0.05)，且其表达的强弱与肿瘤的分期和解剖部位无关。 2.在结直肠癌患者中，28例病理诊断阳性的淋巴结中27例检出GCCmRNA，阳性检出率为96.43％(27/28)，29例常规病理阴性病例中5例检测到GCCmRNA的表达。 结论： 1.GCC在结肠癌组织中的表达明显增强，表达强度与肿瘤的分期和解剖部位无关。 2.GCC在结直肠癌患者淋巴结中的表达与肿瘤的转移有关，GCCmRNA表达对于临床诊断结直肠癌转移具有重要意义。 3.荧光定量RT—PCR法检测GCC mRNA表达快速，准确，可以提高淋巴结微转移检出率。 小结： 1.硅胶膜—离心柱法提取石蜡包埋组织中的RNA简便、经济、快速，可用于临床研究。 2.制备定量GCC的标准品，可应用于荧光定量RT—PCR定量检测。 3.GCC在结肠癌组织中的表达明显增强，表达强度与肿瘤的分期和解剖部位无关。 4.GCC在结直肠癌患者淋巴结中的表达与肿瘤的转移有关，GCC mRNA表达对于临床诊断结直肠癌转移具有重要意义。 5.荧光定量RT—PCR法检测GCC mRNA表达快速，准确，可提高淋巴结微转移检出率。