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目的:
本研究旨在通过体内外实验研究HLA-G对卵巢癌细胞侵袭、转移能力及对荷瘤小鼠生存时间的影响,探讨HLA-G在卵巢癌转移过程中发挥的作用。
方法:
1.HLA-G真核表达载体构建、转染及鉴定将HLA-G全长基因连接到真核表达载体pVITRO2-mcs上,经限制内切酶双酶切及测序鉴定质粒构建正确性。将HLA-G/pVITRO2-mcs及阴性对照pVITRO2-mcs转染到人卵巢癌细胞株HO-8910和Ovcar-3,分别经转录水平及翻译水平鉴定转染细胞中HLA-G表达情况。
2.transwell细胞培养及3D细胞培养采用transwell细胞培养技术检测人卵巢癌细胞株HO-8910和Ovcar-3转染HLA-G基因前后,细胞迁移及侵袭能力变化。同时,采用3D细胞培养技术观察人卵巢癌细胞株HO-8910转染HLA-G基因前后,细胞形成多细胞球体的三维结构情况。
3.动物体内研究分别将人卵巢癌细胞HO-8910、HO-8910-G、Ovcar-3、Ovcar-3-G及对照PBS种植到荷瘤小鼠体内,观察裸鼠生长情况及体表瘤体情况,记录荷瘤小鼠体表肿块大小及死亡时间;对荷瘤小鼠各个脏器进行组织病理学分析,观察组织形态学改变及癌转移情况;采用免疫组织化学方法检测荷瘤小鼠脏器组织HLA-G的表达情况;此外,采用Kaplan-Meier分析方法对荷瘤小鼠进行生存分析。
结果:
1.HLA-G真核表达载体构建、转染及鉴定经限制性内切酶双酶切及测序证实HLA-G/pVITRO2-mcs构建成功,经RT-PCR、western blot及流式细胞术证实HLA-G转染人卵巢癌细胞株HO-8910和Ovcar-3成功。
2.transwell细胞培养及3D细胞培养经transwell细胞体外培养,结果显示,HO-8910和HO-8910-G细胞体外迁移能力具有显著差异(p=0.02)。在上室底部加入Matrigel,凝固后进行transwell细胞培养,结果显示,HO-8910和HO-8910-G、Ovcar-3和Ovcar-3-G细胞体外侵袭能力均具有显著的差异(p<0.001)。采用3D细胞培养结果表明HO-8910-G细胞呈现一种多细胞球体的三维结构,这种构象更加有利于细胞的侵袭,而HO-8910细胞则不呈现这种多细胞球体的三维结构。
3.动物体内研究分别将HO-8910、HO-8910-G、Ovcar-3、Ovcar-3-G细胞接种到荷瘤小鼠,组织病理学分析显示,HO-8910-G和Ovcar-3-G接种裸鼠体内的肿瘤具有更强的转移能力,在肌肉、肺、心脏、肾脏均发现肿瘤转移灶。而HO-8910和Ovcar-3组未发现明显的肿瘤转移。免疫组织化学法检测结果表明,HLA-G表达在种植了HO-8910-G和Ovcar-3-G裸鼠的肿瘤原发灶和转移灶上,而HO-8910和Ovcar-3组均未表达HLA-G分子。此外,HO-8910-G接种的裸鼠,其中位数生存时间为48天(95% CI:38.4-57.6),明显比HO-8910组(93天,95% CI:82.2-103.8)缩短(p=0.001)。Ovcar-3-G接种的裸鼠,其中位数生存时间为57天(95% CI:46.2-67.8),明显比Ovcar-3组(82天,95% CI:736.-90.4)缩短(p=0.002)。HO-8910组与HO-8910-G组、Ovcar-3组与Ovcar-3-G组裸鼠的生存时间均存在显著性差异(p<0.01)。
结论:
HLA-G抗原在人卵巢癌的发生发展过程中扮演着重要的角色,其表达更利于人卵巢癌细胞的转移、侵袭及成瘤能力。此外,HLA-G表达与荷瘤小鼠预后显著相关,可作为一个潜在的独立预后因素。