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目的:
1.体外培养人脂肪源性间充质干细胞，并以黄芪甲苷孵育，研究黄芪甲苷对脂肪源性干细胞体外生物学行为的影响;
2.进一步研究黄芪甲苷孵育后的脂肪源性干细胞对顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用及作用机制。
方法:
1.黄芪甲苷(Ast)孵育人脂肪源性干细胞(hADSC)最佳条件筛选:hADSCs贴壁后光镜观察细胞形态，选取P3-P5代细胞进行实验。将hADSC分为对照组与实验组，对照组以含10％胎牛血清(FBS)的完全培养基培养，实验组在完全培养基中加入不同浓度Ast(10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l)，分别培养24h、48h、72h。Cell-CountingKit-8(CCK8)测定细胞增殖，免疫细胞化学观察细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。根据以上结果选取Ast最佳的干预条件（药物浓度和孵育时间）对hADSCs进行培养，并与对照组比较，光镜下观察药物干预后的细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面标志物（CD分子），以及干细胞多向分化潜能的鉴定（成骨及成脂诱导）。
2.顺铂诱导肾小管上皮细胞(HKC)损伤建立体外AKI细胞模型:将HKC细胞分为正常对照组和顺铂诱导损伤组，对照组以含4％FBS的DMEM/F-12培养基培养，损伤组HKC贴壁后培养液中加入不同浓度的顺铂(2.5umol/l、5umol/l、10umol/l、20umol/l)分别诱导6h和24h。光镜观察各组HKC形态，CCK8检测HKC增殖情况，从而筛选出顺铂诱导的浓度范围和时间。
3.Ast孵育后的hADSC对顺铂诱导的HKC损伤的影响:将hADSC和HKC按4×105/4×105比例接种于Transwell共培养板的上下室，建立上下双层共培养体系。HKC贴壁后经一定浓度顺铂诱导24h后与20mg/lAst孵育的hADSCs共培养48h，48h后FACS和TUNEL方法检测HKC的细胞凋亡;PCNA反映HKC增殖情况;ELISA检测下室HKC培养液中TNF-a、IL-6、RANTES、EPO、HGF、IGF-1的表达;Westernblot检测凋亡相关蛋白caspase-3、bax、bcl-2的表达;结晶紫染色观察上室膜下hADSC的迁移指数。
结果:
1.CCK8检测hADSC的增殖结果显示，随着孵育时间延长，各组细胞增殖逐渐增加，但孵育48h后细胞增殖速度减缓，48h与72h之间差异无统计学意义(p＞0.05)。与对照组比较，随着药物浓度的增加，实验组细胞增殖明显增加;与Ast10mg/l组相比，20mg/l和30mg/l组细胞增殖明显(p＜0.05)，40mg/l组差异无统计学意义(p＞0.05)，Ast20mg/l与30mg/l组之间差异无统计学意义。PCNA染色结果也显示，Ast20mg/l干预48h后hADSC的增殖及PCNA的表达较明显。进一步选取Ast20mg/l干预hADSCs48h，与对照组相比，两组细胞CD29、CD44、CD105的阳性率均为96％-99％;两组细胞成骨诱导与成脂诱导结果也无明显差异。
2.不同浓度的顺铂诱导HKC相应时间后，CCK8检测HKC增殖情况显示，顺铂诱导6h，与正常对照组相比，各组的差异均没有统计学意义(p＞0.05);诱导24h后，对照组OD值为(1.659±0.02)，2.5umol/l组为(1.335±0.03)，5umol/l组为(0.998±0.03)，而随着浓度增加，OD值明显减小，40umol/l顺铂组为(0.264±0.01)，与对照组相比，顺铂诱导24h各组的差别均有统计学意义(P＜0.01)。镜下观察随着顺铂浓度增加，细胞漂浮坏死的比例加大，因此选取2.5umol/l、5umol/l、10umol/l顺铂浓度诱导HKC24h进行后续实验。
3.hADSC与HKC共培养48h后，FASC和TUNEL结果均显示，与HKC损伤组相比，ADSC/HKC组和ADSC-20mg/lAst/HKC组HKC发生凋亡的比例和数量明显减少，PCNA染色显示两组的细胞增殖数量多于HKC损伤组;ELISA结果表明与HKC损伤组相比，ADSC-20mg/lAst/HKC组IL-6、RANTES水平明显降低，而EPO、IGF-1分泌显著提高，差异具有统计学意义(p＜0.05);Westernblot提示与损伤组相比，20mg/lAst-hADSC/HKC组HKC细胞Bax的表达没有明显变化而caspase-3含量减少、Bcl-2的蛋白表达增加;结晶紫染色显示ADSC-20mg/lAst/HKC组ADSC的迁移指数高于其余各组(p＜0.05)。
结论:
1.Ast可促进ADSCs增殖，以20mg/l、孵育48h为最适干预条件，且该条件干预后并不影响hADSCs细胞形态，表面标志物水平及多向分化能力。
2.受损HKC可刺激hADSC的定向迁移，且迁移数量与HKC损伤程度相关;Ast孵育后可促进hADSC向AKI损伤微环境下的定向迁移，又可增强其旁分泌效应、抑制HKC炎症因子分泌，并调控肾小管细胞凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2的表达。