[背景]人类肠道病毒(Human Enteroviruses, HEVs)隶属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),以隐性感染为主,可引起如急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paraiysis, AFP)、无菌性脑膜炎(Aseptic Meningitis, AM)、心肌炎、急性出血性结膜炎(Acute Hemorrhagic Conjunctivitis, AHC)、手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)等多种临床疾病,还可引起新生儿全身感染,甚至死亡。传统上将HEVs按血清型分为脊髓灰质类(脊灰)病毒(Polioviruses, PV),柯萨奇病毒A类(Coxsackievirus A, CVA),柯萨奇病毒B类(Coxsackievirus B, CVB),埃可病毒类(Echovirus, Echo)。2011年11月,国际病毒分类委员会(International Committeeon Taxonomy of Viruses, ICTV)发表了最新的病毒分类第九次报告,将人鼻病毒(Human rhinovirus, HIRV)归入肠道病毒属,HEVs重新划分为7组,即HEV-A-HEV-D和HRV-A-HRV-C。HEVs具有独特的向外环境排毒的方式,病毒感染易感者后,受感染的个体无论有无临床症状都会持续向外环境排出带有病毒的粪便,大约持续数周。大量排到环境中的病毒颗粒,依不同的环境条件能够存活不同的时间,并在这段时间内保持感染性。在此期间,采集生活污水标本,即可通过不同的实验方法对环境中的HEVs进行浓缩、分离以及鉴定。通常HEVs在污水中的含量极少,浓度极低,难以满足直接检测的需求,因此,水体中病毒的浓缩富集是病毒检测过程中一个重要的环节,是决定检测成功或失败的关键因素。目前,浓缩环境污水标本的方法主要有吸附-洗脱法、膜过滤法和化学絮凝沉淀法等。吸附-洗脱法和膜过滤法被广泛应用于水体中病毒的富集检测。本研究将两种方法结合起来,并进行了改进和优化,在高镁离子浓度、低pH值条件下,采用阴离子膜吸附病毒,再加入洗脱剂,并使用超声波振荡,使病毒从滤膜上洗脱下来。在全球消灭脊灰行动计划中,AFP监测系统可提供特定区域内PV以及其他非脊灰肠道病毒(Non-polio Enterovirus, NPEV)分布的基线数据,但由于AFP发病率低,且HEVs多以无症状感染为主,该数据尚不能完全反映HEVs的流行现状；而环境监测是检测PV野毒株和疫苗株最敏感的方法,也是监测HEVs循环的有效手段。因此,在我国实现无脊灰目标之后,在加强AFP监测工作的基础上,优化环境污水中HEVs的浓缩分离方法,并将其应用于PV及NPEV的监测研究,对于发现可能存在的PV野毒株(Wild Poliovirus, WPV)及PV疫苗衍生株(Vaccine-derived Poliovirus, VDPV),以及追踪引起非显性感染的NPEV传播及其预测疾病的发生,均具有十分重要的理论和实际意义。[研究目的]1.探索优化环境生活污水中HEVs的浓缩分离方法；2.摸清采样点环境生活污水中HEVs的分布,分析环境生活污水中PV和非NPEV的基因变异；3.通过比较环境生活污水监测和临床病例中HEVs的基因进化特征,预测HEVs相关疾病的暴发和流行,评价环境监测在发现VDPV和WPV中的作用。[研究方法]1.选择济南市光大生活污水处理厂、临沂市首创水务生活污水出口处作为采样点,定期采集生活污水样本,采用阴离子膜-超声波振荡法进行HEVs的浓缩富集；2.将处理后的污水样本,采用RD、 Hep-2和L20B细胞进行病毒分离；通过微量板中和实验,对病毒分离阳性的毒株进行血清学型别鉴定；3.提取核酸,进行HEVs衣壳蛋白VP1编码区基因扩增和序列测定,通过与标准株进行比对,确定HEVs的基因型；4.选取环境生活污水中HEVs主要的血清型,采用BioEdit Sequence Alignment Editor software7.1.3软件,与山东省AFP病例分离株、有关临床病例分离株以及GenBank中检索到的其它国家和地区相同血清型分离株的VP1区核苷酸序列进行同源性比较；5.采用Mega3.1软件,邻接法(Neighbor-joining Method)构建VP1区系统发生树,对环境生活污水中HEVs主要的基因型别进行亲缘进化分析。[主要结果]1.环境生活污水中HEVs的分布：2008～2010年,在山东省济南市和临沂市共采集生活污水标本99份,72份分离到病毒,阳性率为72.7%。在环境生活污水中分离到的病毒包括5株2型腺病毒、58株PV疫苗相关株病毒和631株B组HEVs,其中,HEV-B包括17种血清型,分别为：Echo1、Echo3、Echo6-7、 Echo11～14, Echo19、 Echo25、 Echo29～30、 CVB1-5型；其中,Echo6、 Echo7、 Echo11、 Echo12、CVB3分离数目较多。2.环境污水中PV的分离情况及其变异重组分析：2008～2011年,共采集污水标本99份,PV阳性者28份,阳性率为28.3%。分离到58株PV,均为疫苗相关株,未发现脊灰野毒株(WPV)和疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)。齐南市环境污水中分离到39株PV,PV2是主要的血清型；临沂市环境污水中共分离到19株PV,PV3是主要的血清型。PV全年均可分离到,无明显季节性分布。对2010年分离到的18株PV进行VP1区域和3D区序列测定,与Sabin疫苗株病毒进行同源性比较显示：16株PV在VP1区发生核苷酸变异,8株在3D区发生核苷酸变异。序列分析显示：7株(38.9%)发生基因型间重组,未发现与非脊灰肠道病毒(NPEV)发生重组。3.环境监测与疾病监测中NPEV型别分布的比较：临沂市2010年环境监测中,共发现Echo6-7、 Echo11、Echo13、 Echo19、 Echo30、 CBV1-2、 CVB4等9种NPEV血清型,而同时期相关病例监测分离到的NPEV血清型为Echo6、 Echo9、 Echo16、 Echo30、 CVB4、 CVA4、 CVA9、CVA10、CVA16、 EV71等。通过比较环境监测和AFP病例监测系统中NPEV血清型,发现AFP监测系统中分离数最多的21种血清型中,包含了环境监测中分离到的17种血清型,二者的一致性很高。4.环境监测与疾病暴发优势株HEVs的遗传进化分析：①VB3和CVB5是山东省AM的主要病原,毒株之间的变异进化速度相对较慢,环境监测分离株AM分离株亲缘关系较近,CVB3有明显的地域聚集性,有多个传播链流行；②Echo6和Echo11较少引起疾病发生,毒株进化较为迅速,环境监测分离株存在着两个进化分支,同一份标本的不同分离株在系统发生树上位于不同进化分支,有多条传播链共同循环；③Echo30也是山东省AM的主要病原之一,环境污水中分离数较少,与AM分离株亲缘关系较近,都属于F基因型。[结论与建议]1.采用阴离子膜吸附-超声波震荡的浓缩分离方法,对环境生活污水中不同血清型的HEVs具有较高的敏感性,特别可发现不引起临床症状的HEVs,是追踪HEVs非显性感染最有效的手段。2.在维持无脊灰阶段,通过环境监测未发现PV野毒株和疫苗衍生株病毒。采用环境监测检测环境污水中PV的变异和重组情况,不受采集病例标本的限制,可作为AFP监测系统之外评估人群中PV流行一种的补充手段。3.通过同源性比较和生物信息学分析发现,HEVs各血清型毒株VPl区核苷酸序列较原型株均发生了较大变异,环境监测与疾病暴发优势株存在一定的遗传进化关系。4.建议推广优化环境生活污水中HEVs的浓缩分离方法,并将其应用于环境的长期监测,以获得HEVs和其他病原体的流行状况,为预防相关疾病的发生和流行提供科学依据。