背景宫颈癌和乳腺癌是近年来常见的妇科恶性肿瘤,发病率位居我国女性恶性肿瘤的前列,且呈逐年上升趋势。针对肿瘤防治,首要的原则是早发现早治疗。因此,在肿瘤发生发展过程中,对细胞遗传学改变的检测,是肿瘤早期发现和有效治疗的重要手段,对于改善患者预后、提高生存质量具有重要意义。目前国际上通用的宫颈癌和乳腺癌的筛查方法一般为宫颈细胞形态学检查、人类乳头瘤状病毒(HPV)检测和影像学检查、免疫组化(IHC)检测等。前者细胞涂片的敏感性一般在55-80%左右,但一旦发现异常细胞,特异性可达到90%以上。HPV检测虽然敏感性高,但特异性一般只有64-95%之间,并且部分HPV阳性病人可自然转阴,或并非高危型感染,并不导致癌症发生。而影像学检查对于微小病灶和癌前病变的诊断,极易造成假阴性,IHC对于17号染色体的非整倍体现象无法判别,使假阳性无法避免。因此,传统的检测手段在敏感性和特异性上均无法达到两者兼顾。荧光原位杂交(FISH)是细胞原位分子杂交与荧光技术相结合的一项技术,与传统的细胞遗传学技术比较,具有敏感度高、信号强、快速简便、定位准确等优点。利用该技术可以进行实体瘤中染色体结构异常、染色体数目异常、基因定位的细胞遗传学研究。FISH技术将细胞遗传学改变与细胞类型、位置、组织学结构联系起来,可用于研究遗传物质与肿瘤的动态变化之间的的关系,有助于早期发现在组织病理形态学改变之前的微小遗传物质变化,检出在大量细胞中所出现的低频率染色体异常,灵敏度达1/1000,为肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗提供有力依据。基因扩增是指一种基因在细胞中的拷贝数量相对增加,是肿瘤细胞中许多种类的癌基因过度表达的一种机制。扩增的范围从每个细胞中的一到两个拷贝到上千个拷贝,癌基因的扩增与肿瘤的选择性生长优势或肿瘤细胞的耐药性机制有关。目前,各种直接标记的探针系统已被应用于不同肿瘤的扩增基因检测上,FISH的分析方法非常适合研究扩增基因,具有极好的灵敏性,并且能够很好的展示细胞的异质性。hTERC(人类染色体端粒酶模板)基因位于3q26.3。端粒酶是由RNA和蛋白质亚基组成的核糖核蛋白复合物,以自身RNA组分为模板、蛋白质组分具有催化活性的逆转录酶,合成人的端粒重复序列(TTAGGG)n,维持端粒长度,其活性被认为与癌细胞的永生化有关。因为在真核生物细胞的正常周期中,真核细胞染色体末端的端粒会随着细胞分裂而缩短,直至细胞衰老死亡。而该基因的扩增可以阻止细胞凋亡,从而导致肿瘤产生。hTERC基因的异常扩增很可能是肿瘤形成的早期事件。因此,对肿瘤细胞hTERC基因扩增的检测有助于肿瘤的筛查及早期诊断。Her-2/neu原癌基因定位于17q21,属于受体酪氨酸激酶(RTK)类癌基因,编码具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体C-erb-2。Her-2/基因的扩增和蛋白的过表达可导致生长因子信号传导失常,细胞周期调控紊乱,细胞凋亡受抑制从而促进肿瘤的发生、发展、浸润和转移。据资料显示,约1/3的浸润性乳腺癌存在Her-2基因的扩增或过表达,这类乳腺癌恶性程度高,复发和转移早,DFS和OS低,尤其对常规内分泌和化疗方案不敏感。因此,Her-2可作为抗肿瘤药物的适宜靶点。Rastuzumab (Herceptin)——第一种针对细胞表面Her-2蛋白的人源化单克隆抗体治疗药物——对抗肿瘤治疗有重要意义。然而,作为抗肿瘤的治疗靶点和判断预后的独立标志物之一,亟需准确测定Her-2的状态,它的阳性与否,是指导Herceptin临床用药的标准。本研究旨在建立标准的FISH实验检测步骤。影响FISH检测质量的因素很多,包括标本的种类、采集方法、标本的新鲜程度、杂交前的预处理、杂交条件等。每一个因素都将影响FISH实验的最终结果。因此,就需要针对不同的情况摸索出最佳的实验条件。探讨如何在常规获得的细胞标本上进行基因的扩增检测,并探讨将hTERC基因其作为宫颈癌早期诊断标志物的可行性。目前对于hTERC和Her-2基因与宫颈癌和乳腺癌相关性的研究多来自国外报道,为进一步在我国临床推广建立FISH检测平台,探索中国人群的检测限值,对生物个体的遗传学改变进行分析研究,不仅对癌前诊断,而且对靶向治疗药物的研究和使用,都是必要的。方法1.在前期研究和实验基础上,建立FISH技术检测宫颈上皮脱落细胞和乳腺组织上皮细胞的完整方法学平台。标准化宫颈上皮细胞滴片标本和乳腺组织切片标本的采集和前期处理方法。宫颈上皮脱落细胞分别采用薄层细胞学检测(TCT)和生理盐水取材,乳腺组织上皮细胞分为石蜡切片和冰冻切片两种,并对其检测步骤进行标准化,和杂交条件的摸索,以确保结果的稳定性。建立标本的检测阈值。采集10例正常人宫颈上皮细胞以前期实验的标准方法进行FISH实验,每例分析至少100个细胞,统计出现2个以上hTERC信号细胞数目的百分比,阈值=平均数(M)+3×标准差(SD)。乳腺组织上皮细胞标本的阈值则参照美国临床肿瘤协会(ASCO)和美国病理学家协会(CAP)联合制定的乳腺癌Her-2临床检测指南执行。2.以临床95例宫颈上皮细胞标本为检测对象,比较四种不同病理病变程度的标本中,FISH检测hTERC基因扩增的阳性率,同时以病理诊断为标准,以杂交捕获方法(HC-2)检测每例标本的高危型HPV感染情况。对两种检测对象和检测方法分别进行比较与评估,探讨其在宫颈癌早期诊断中意义。3.以临床40例乳腺浸润性导管癌(IDC)上皮细胞标本为检测对象,分别以FISH和IHC方法检测Her-2的扩增和过表达情况,确定其在乳腺IDC患者中的发生比例,并比较两种方法检测结果的一致性。对建立的FISH方法进行方法学比较与评估,确定临床样本检测的规范步骤。结果1.成功构建稳定的FISH方法学平台。对不同来源和类型的标本均可稳定检测,杂交信号清晰,具有较好的重复性。宫颈上皮细胞标本中hTERC基因的检测阈值为大于或等于1.7%。2. 95例宫颈上皮细胞标本中hTERC基因扩增检测显示:1)炎症/ CINⅠ组的扩增阳性率3.13%(1/32)与其余各组比较,均有非常显著性差异(P<0.01)。2)宫颈上皮内高度病变CINⅡ/Ⅲ的扩增阳性率为65.8%(25/38),与炎症/ CINⅠ组比较,有非常显著性差异(P<0.01);与宫颈癌组比较,有显著性差异(P<0.05)。3)宫颈癌组的扩增阳性率为93.3%(14/15),与CIN各组的hTERC基因扩增阳性率比较均有显著性差异(P<0.05)。4)CINⅢ组与宫颈癌组比较,差异无显著性意义(P>0.05)5)hTERC基因扩增的阳性率随病理级别的升高而增高,病变程度与扩增的阳性率成正相关关系(r=0.947,P<0.05)。6)FISH方法检测hTERC基因扩增和HC-2方法检测HR-HPV感染,分别的敏感性(Se)为39/53(73.6%),37/53(69.8%);特异性(Sp)为31/32(96.9%),17/32(53.1%);阳性预测值(PPV)为39/40(97.5%),37/52(71.2%);阴性预测值(NPV)为31/45(68.9%),17/33(51.5%)。3. 40例乳腺IDC上皮细胞标本的Her-2检测结果显示:1)37.5%(15/40)的乳腺IDC病例存在Her-2基因扩增。42.5%(17/40)的乳腺IDC病例存在Her-2蛋白过表达。2)8例IHC结果(3+)的标本,FISH检测结果均为阳性;9例IHC结果(2+)的标本中,6例FISH检测结果阳性;23例IHC结果(-/1+)的标本中仅1例FISH检测结果阳性。两种检测方法的结果经统计学分析具有一致性趋向(Χ2=46.73,P=0.000)。结论1. hTERC基因参与上皮细胞内瘤变(CIN)和宫颈癌的发生发展,hTERC基因扩增的阳性率随病理级别的升高而增高,可作为CIN和宫颈癌的标志物之一。2. hTERC基因的FISH检测比HR-HPV DNA检测能够更可靠地鉴别宫颈良恶性病变,前者的特异性和阳性预测值均明显高于后者,二者联合检测将为提高宫颈癌的早期诊断率提供更有效、更合理的方案。3. FISH方法和IHC方法检测Her-2/neu扩增或过表达情况在统计学上具有一致性结果。FISH方法中着丝粒探针和位点特异性探针的联合使用,不仅可以进行形态学观察和扩增检测,还能校正IHC无法检出的染色体非整倍体现象造成的假阳性问题。可作为Her-2/neu检测的确认方法。4.所构建的FISH检测方法学平台,可在24h左右检出某些肿瘤在染色体和单基因上的异常,并可应用于细胞滴片、组织石蜡切片和冰冻切片的检测,有望克服临床常规检测方法存在的问题,应用前景广泛。