microRNAs（miRNAs）是人和动物体内的单链非编码小RNA。在体内，miRNA与AGO等蛋白形成miRISC（miRNA associated RNA induced silencing complex），识别并结合mRNA中靶序列，通过降低mRNA稳定性和抑制mRNA翻译负调节基因的表达，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。研究miRNA的表达、功能及相应的调节机制具有重要的意义。高通量的miRNA检测方法是miRNA功能研究的基础。目前已建立qRT-PCR、miRNA microarray和RNA测序等多种高通量miRNA表达谱检测方法。然而，miRNA活性更直接体现miRNA功能，不仅与miRNA表达关系密切，还受到细胞中蛋白因子、miRNA定位和miRNA靶序列数量等因素影响。建立简单方便的高通量miRNA活性谱检测方法十分必要。miRNA活性检测传感器的设计及规模化制备和高通量基因转导技术是建立高通量miRNA活性谱检测方法的关键。本论文突破这些关键技术，首先建立一种简单方便的高通量活细胞miRNA活性谱检测方法miRNAAsensor arra（yadeno-associated virus (AAV) vectorbased miRNA sensor array）；然后将miRNAAsensor array技术应用于细胞miRNA活性谱特征性分析，病毒癌基因对细胞miRNA活性影响研究，细胞分化过程中miRNA活性谱变化监测和BHK21细胞中特征性高活性miRNA的发现；最后，建立一种体内miRNA活性检测方法，用于研究特征性miRNA在活体小鼠肝脏内的活性。为了建立一种高通量的miRNA活性检测技术，我们首先构建了115种miRNA活性检测AAV载体质粒传感器miRNA Dsensor。miRNA Dsensor携带分泌型荧光素酶Gluc基因和萤火虫荧光素酶Fluc基因两个独立的表达框。Gluc基因表达框的3′端非翻译区（3′-untranslated region，3′UTR）中包含单个的完全互补的miRNA靶序列，用于感知细胞中miRNA活性；Fluc基因表达框不受miRNA调控，用于校正不同miRNA Dsensor的转导效率差异。选择了55种miRNA Dsensor，用转染方法分别导入HEK293细胞中，通过测定细胞上清中Gluc活性及细胞裂解液中Fluc活性，经过计算获得每种miRNA的相对抑制活性，绘制成活性谱。结果显示miRNADsensor能够有效地检测HEK293细胞中miRNA活性，表明了miRNADsensor设计的合理性和功能的有效性。然而质粒转染方法在应用时操作比较繁琐且不利于质量控制。为了更便捷和高效地转导细胞，我们采用了AAV病毒载体。将每种miRNADsensor分别制备成相应的重组AAV2病毒，即miRNAAsensors。将多种miRNAAsensors有序地包被于96孔细胞培养板上，获得可高通量检测miRNA活性谱的miRNA Asensor阵列（miRNA Asensor array）。应用时，将待检测的细胞等量加入miRNAAsensor array板中，包被其上的AAV病毒“反向感染”细胞，将传感器带入细胞中而表达报告基因，测定报告基因表达，推算获得检测miRNA活性谱。接下来分析了细胞数量和取样时间对miRNA活性检测结果的影响。结果表明，细胞数量的适宜范围为3125-25000/孔；取样时间的适宜范围为36-60h。为了排除不同传感器因AAV病毒载体转导效率的差异对miRNAAsensor array方法测定miRNA活性的影响，我们选用对于AAV2载体体外感染十分敏感的BHK21细胞来测定转导系数。首先，用不携带miRNA靶序列的空白传感器（Control Asensor）感染BHK21细胞，获得不受miRNA活性抑制时Gluc和Fluc表达活性关系。将ControlAsensor的转导效率定义为1个转导系数（transductioncoefficient，TC）单位，那么miRNAAsensor的TC值为其不受miRNA抑制时Gluc表达活性和Control Asensor的Gluc表达活性的比值。根据Gluc和Fluc关系，miRNA Asensor的TC值计算为miRNA Asensor和Control Asensor的Fluc比值的1.32次方。依据miRNA抑制基因表达的原理，考虑到不同miRNAAsensor之间转导效率差异，miRNA活性表示为ControlAsensor和miRNAAsensor的Gluc活性的比值与miRNAAsensor的TC值的乘积，即相对抑制倍数（relative inhibiting fold， RIF）。以HEK293细胞为例，比较分析了细胞中miRNA活性和表达水平关系，发现miRNAAsensorarray能够有效地检测细胞中非家族性miRNA活性。建立了miRNA Asensor array分析方法后，我们尝试了用该方法进行高通量的miRNA活性测定。制备了一套含有115种miRNA传感器的miRNA Asensor array，分别检测了9种细胞的miRNA活性谱。每种细胞在48h内得出结果，9种细胞检测可同步进行，迅速比较出不同miRNA在细胞中的活性差异以及同一种miRNA在不同细胞株之间的活性差异，表明了所建方法的高效和便捷。我们发现不同细胞的miRNA总活性存在明显差异，肿瘤来源细胞（K562、U937、HepG2和Huh7/CD81）miRNA总活性明显低于正常组织来源细胞（BJ和C2C12）。组织特异性表达miRNA（miR-122，miR-194，miR-142-3p和miR-142-5p）在各自相应组织来源细胞（HepG2、Huh7/CD81、U937和K562）中特异性高活性。对肿瘤具有抑制作用的miRNA（let-7a，miR-31，miR-199a-3p和miR-143）在正常组织来源细胞（BJ和C2C12）中活性明显高于肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81、U937和K562）。对肿瘤具有促进作用的miRNA在不同来源细胞间活性规律存在差异，miR-17-5p在肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81、HeLaS3、U937和K562）中明显高于正常组织来源细胞（BJ、C2C12和BEAS-2B）；miR-221/222在正常组织来源细胞（BJ、BEAS-2B和C2C12）和某些肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81和HeLaS3）中较高，而在U937和K562等肿瘤来源细胞中则较低。miR-21则在所有检测的9种细胞中都具有较高的活性。对肿瘤具有复杂作用的miR-26a活性则在正常组织来源细胞（BJ和BEAS-2B）和某些肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81和HeLaS3）中都较高，而在U937和K562等肿瘤来源细胞中较低。这些结果显示miRNAAsensor array方法能够高效快速地比较和发现出不同细胞之间miRNA活性谱差异，为miRNA的功能和作用机制研究提供线索。结果还提示miRNA在肿瘤中作用的复杂性，因此从功能水平上（癌基因和抑癌基因）区分miRNA需要更多的实验证据。根据9种细胞的115种miRNA活性谱综合评价结果，我们初步选择出13种特征性的miRNA，进一步分析了9种细胞中这13种miRNA活性谱，发现不同的细胞间该13种miRNA活性谱差异明显，提示有限种类的miRNA活性谱可能作为一种生物标记，用于细胞特征鉴定。为了分析外源基因导入对于细胞内miRNA的活性影响，我们以SV40大T抗原为例，分析了其对HEK293细胞miRNA活性影响。首先扫描获得HEK293和SV40大T抗原稳定表达细胞株HEK293T的115种miRNA活性谱，发现HEK293T细胞miRNA总活性明显低于HEK293。具体分析发现，相比于HEK293细胞，HEK293T细胞中let-7家族（除let-7i外）和miR-26a活性明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.01)，miR-17-92cluster中miR-18a和miR-20a活性则明显升高(P<0.05)，差异也具有统计学意义。而两种细胞中miR-221和miR-222活性却未见统计学差异。值得注意的是，HEK293T细胞中miR-21活性和表达水平都显著低于HEK293细胞(P<0.01)。在此基础上，构建了SV40大T抗原的表达载体pSV40LT，Westernblot检测结果表明pSV40LT能够有效地表达SV40大T抗原。分析比较了HEK293细胞转染pSV40LT载体前后miRNA活性变化。结果发现，转染pSV40LT后，HEK293细胞中115种miRNA总活性也明显下降。具体地，相比于HEK293细胞，转染pSV40LT后HEK293细胞let-7家族（除let-7i外）和miR-26a活性下降，且差异具有统计学意义(P<0.05)，miR-21活性也有下降，但差异不具有统计学意义；miR-17-92cluster和miR-221/222却未见明显差异。结果表明，SV40大T抗原能够影响HEK293细胞中miRNA活性，为从miRNA水平上揭示SV40大T抗原的致癌机制提供了新的线索。我们以TPA（phorbol12-myristate13-acetatefor）诱导K562细胞分化为例，应用miRNAAsensor array技术监测诱导分化前后细胞miRNA活性谱的变化。首先，观察发现TPA诱导K562细胞24h后，K562细胞形态特征发生明显变化。miRNA活性谱扫描发现诱导48h后，K562细胞115种miRNA总活性明显升高。具体分析发现，10种miRNA（miR-221，miR-222，miR-34a，miR-21，let-7a，let-7b，let-7c，let-7e，let-7f和miR-146a）活性明显升高，3种miRNA（miR-106a，miR-144和miR-32）活性显著下降。结果显示miRNAAsensorarray技术有效地监测了TPA诱导K562细胞分化过程中miRNA活性变化，为细胞生理过程中的miRNA活性变化研究提供了新的选择工具。比较了三种肾来源的细胞BHK21、HEK293和Vero的58种miRNA活性谱，发现BHK21细胞中miR-206特征性高活性。具体地，miRNA序列保守性分析找出58种在BHK21细胞中可能表达miRNA序列，制备相应的miRNAAsensor array。扫描获得BHK21、HEK293和Vero等三种肾脏来源细胞58种miRNA活性谱，特征性发现BHK21细胞中miR-206高活性。以HEK293细胞为阴性对照，小鼠成肌细胞C2C12为阳性对照，证明了BHK21细胞中miR-206高活性和高表达，验证了发现结果。马血清（HS）诱导培养BHK21细胞后，细胞形态发生变化，WB检测到骨骼肌球蛋白重链(MHC)表达，表明BHK21细胞呈肌细胞分化。诱导培养后，BHK21细胞中miR-206活性和表达水平明显上升。探索发现miR-206可能通过下调连接蛋白43（Cx43）参与BHK21细胞诱导分化过程。结果提示，miR-206可以作为一种鉴别BHK21细胞的特征性生物标记之一。最后，我们还建立了一种小鼠体内miRNA活性检测方法，测定了小鼠正常肝脏中miR-21活性。首先以空白对照Control Psensor为基础，构建了miR-21、miR-122和miR-206三种体内miRNA活性检测质粒型传感器miRNAPsensor。其中miR-122和miR-206Psensor分别用作miR-21活性检测的阳性和阴性对照。用水动力法将Control Psensor和3种miRNAPsensor分别注射至不同小鼠体内，测定报告基因表达，计算获得miRNA活性。结果发现，小鼠肝脏中miR-21和miR-122活性较高，且miR-21明显高于miR-122，而未检测到miR-206活性。qRT-PCR结果发现小鼠肝脏中miR-21表达水平低于miR-122。本研究首次发现小鼠正常肝脏中miR-21活性明显高于miR-122，而表达水平却低于miR-122，提示miR-21可能在小鼠肝脏的正常生理活动中发挥重要作用。总之，本论文成功建立了一种高通量的活细胞miRNA活性谱检测方法miRNAAsensorarray。应用该方法分析获得了多种细胞特征性miRNA活性谱，表明miRNA活性谱具有成为一种生物标记用于细胞鉴定的潜力。miRNAAsensor array作为一种方便有效的研究工具，还可用于外界因素对细胞miRNA活性影响、细胞生理过程中miRNA活性监测和细胞特征性高活性miRNA的发现等研究。在体外检测miRNA活性方法的基础上，我们进一步创建了一种活体小鼠肝脏中miRNA活性检测方法，用于miRNA Asensor array发现特征性miRNA的体内活性研究。应用该方法，首次发现小鼠正常肝脏中oncomir miR-21高活性，提示miR-21体内功能的多样性。