研究背景及目的在人类疾病中常出现长链非编码RNA(1ncRNAs)调控紊乱,这一现象在癌症中尤为明显。癌症基因组的杂乱无章及不稳定,主要表现为体细胞拷贝数变化(SCNAs),而这些体细胞拷贝数变化可能引发癌症。大规模的基因组资料和全基因组功能筛查已经成功地应用于识别引发癌症的体细胞拷贝数变化位点。然而,蛋白编码基因仅占人类基因组的2%,许多癌症病灶的体细胞拷贝数变化位点不具有蛋白编码功能。近年来,越来越多的证据也表明,人类大部分基因组具有转录活性,但仅有小部分是蛋白编码基因,这些发现使人们认识到人类基因组包含了众多长链非编码RNA。此外,长链非编码RNA在一系列不同类型的细胞和疾病中发挥着重要的作用,参与调控细胞的不同生物学进程,包括细胞周期、基因稳定性及染色质结构等,这表明长链非编码RNA对细胞功能的调控几乎无处不在。然而,大部分长链非编码RNA的作用机制仍不清楚。因此,进一步探讨长链非编码RNA确切的作用机制及功能有助于我们了解其对人类癌症的影响。小核仁RNA宿主基因3(SNHG3)是一种长链非编码RNA,目前,它在肝癌中的潜在作用及机制尚未有报道。SNHG3,也称为U17的宿主基因(U17HG),位于1号染色体短臂3区6号带。基因内的U17小核仁RNA宿主基因最初由PelczarP发现。这位学者将人类和老鼠的U17HG进行对比,发现在两个物种间小核仁RNA没有蛋白编码特性。我们前期的研究发现,在7对肝癌组织标本的芯片结果中,SNHG3在肝癌组织中的表达高于正常肝脏组织。然而,目前有关SNHG3作用的研究极少,其在肝癌中高表达是否暗含着重大的功能意义尚不清楚。本文的研究目的正是检测肝癌中SNHG3的表达及其临床意义。主要思路为：通过qRT-PCR方法检测51对肝癌组织标本(队列1)中SNHG3的表达,同时也用原位杂交的方法检测144对石蜡包埋的肝癌组织标本(队列2)中SNHG3的表达。然后,分析队列2中SNHG3的表达和患者临床病理特征间的关系。最后,使用COX回归模型进行多因素分析,并结合SNHG3的表达与肝癌患者的总生存时间、无复发生存时间及无病生存时间的关系,明确SNHG3对肝癌患者的预后价值。研究内容一.方法1.组织样本和患者数据所有样本的获取符合南方医科大学,南方医院伦理委员会的协议,参与到本研究的肝癌患者均已签署知情同意书。本研究纳入了来自两个独立队列的共计195位肝癌患者,在队列1中,51对新鲜肝癌组织标本来自2011年1月至2012年7月期间在我院进行首次肝癌手术切除的患者,标本在RNA提取前储存在-80℃的液氮中。在队列2中,144对石蜡包埋的肝癌组织标本来自2006年1月份至2009年7月份期间在我院进行首次肝癌手术切除的患者。所有这些标本收集前均未进行任何抗肿瘤治疗,包括放疗、化疗和手术,研究中对纳入的肝癌组织样本随机选择,对队列2的患者进行5年的随访,所有患者的临床资料将在下文中进行说明(表2-1和表2-2)。本研究按照Edmonson和Steiner建议的标准明确肿瘤分化,按照巴塞罗那临床肝癌分期标准定义肿瘤分期。2.提取RNA,逆转录及实时荧光定量PCR使用TRIzol(？)试剂(Invitrogen,卡尔斯巴德,美国)提取组织样本中的总RNA并使用逆转录试剂盒(Takara生物技术,大连,中国)逆转录成cDNAc qRT-PCR按照Takara生物技术生产的SYBR(？) Green PCR试剂盒(Takara,大连,中国)的使用说明进行操作。SNHG3扩增的条件为：95℃预变性30秒,随后,95℃,5秒,60℃,34秒,共40个循环。所有qRT-PCR的引物特异性和效率性均经过检验。使用2-ΔΔCt相对定量方法计算倍数变化。3.原位杂交按照原位杂交试剂盒(Boster Bio-Engineering公司,武汉,中国)的使用说明进行SNHG3原位杂交检测。片子分别由两位病理专家在显微镜下根据SNHG3阳性细胞的染色强度及比例进行评分。染色强度按照以下的评分标准进行定义：0(阴性),1(弱阳性),2(中等阳性),3(强阳性)。染色比例评分：0(0%),1(1%-25%),2(26%-50%),3(51%-75%),4(76%-100%)。SNHG3表达的最终评分按照染色强度分值+染色比例分值进行计算,总分为0-7分。总分值3分或者更高为高表达组(阳性组)。4. TCGA数据库为了明确SNHG3在肝癌中的表达,本研究使用的RNA测序方法分析来自The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://tcga-data.nci.Nih. gov/tcga/)的肝癌队列。总共有401例样本具有SNHG3表达值,其中50例是正常的肝脏组织,351例是肝癌组织。收集每例样本中SNHG3的表达值,并在肝癌组织标本和正常肝脏组织标本中对比SNHG3的表达水平。5. Oncomine数据库在Oncomine Compendium of Expression Array data (www.oncomine.org)下载了一组Wurmbach Liver的芯片结果。使用Affymetrix U133 Plus 2.0基因芯片分析45例肝脏组织样本,包括35例肝癌组织样本和10例正常组织样本,在肝癌组织样本和正常组织样本中对比SNHG3的表达水平。该芯片数据结果可在UCSC上查询,检索号为AJ006835。6.统计学分析本研究中的统计学分析均使用SPSS软件(Abbott Laboratories, Chicago, IL)来进行,利用生存分析和Log-rank test来检测生存曲线,通过单因素和多因素Cox回归模型来评估影响生存的因素,利用单因素分析明确具有统计学差异的因素,再进一步通过多因素分析来评估它们对肝癌预后的独立影响价值。SNHG3的表达和临床病理特征间的关系通过The Mann-Whitney U-test进行检验,实时荧光定量和数据库中的数据通过Student’s t-test进行分析。当P<0.05时,认为具有统计学差异。二.结果1.SNHG3转录本在肝癌细胞株和肝癌组织中的表达通过实时荧光定量PCR方法检测肝癌细胞株中SNHG3转录本的表达,长度为2238bp的转录本在所有6株肝癌细胞株中表达量最高,而长度为2346bp的转录本则几乎检测不到或低表达。在4对肝癌组织标本中用实时荧光定量PCR检测这两个转录本的表达,也得到一致的结论。2.SNHG3在肝癌组织中高表达用实时荧光定量PCR的方法检测来自51位肝癌患者的肝癌组织标本中SNHG3的表达,相比正常的肝脏组织标本,SNHG3在肝癌组织标本中的表达升高5倍。此外,来自Oncomine数据库(接收号AJ006835,Wurmbach,2007)的Wurmbach Liver芯片结果和TCGA数据集表明SNHG3在肝癌组织中的表达明显高于正常组织。为了进一步明确以上结果,通过原位杂交的方法检测144对石蜡包埋的肝癌组织标本中(队列2)SNHG3的表达,与正常组织相比,SNHG3在91(63.2%)例肝癌组织中的表达明显升高。3. SNHG3与肝癌患者临床病理特征间的关系通过对144位肝癌患者中SNHG3的表达和临床病理特征间的关系进行分析发现：SNHG3的表达与肿瘤大小、门静脉癌栓和复发相关。然而,SNHG3表达与患者性别、年龄、肝硬化、BCLC分期无关。4. SNHG3过表达是肝癌患者预后独立的不良因素通过生存分析和Log-rank分析发现：SNHG3的表达与肝癌患者的总生存率、无复发生存率和无病生存率呈负相关关系。此外,单因素分析预后因素表明SNHG3表达、门静脉癌栓、复发、BCLC分期和肿瘤大小与总生存时间明显相关。使用Cox回归分析模型进行多因素分析表明SNHG3是肝癌患者预后的独立影响因素。三.结论1.与正常肝脏组织相比,SNHG3在肝癌组织中明显高表达。2.SNHG3表达与肿瘤大小、门静脉癌栓和复发呈正相关。3.SNHG3高表达的肝癌患者相比SNHG3氏表达者预后差。4.SNHG3可以作为肝癌患者预后的独立影响因子。