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目的:从细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头蚴中克隆丝裂原活化蛋白激酶激酶(EgMKK1)基因和14-3-3基因,进行序列测定,生物信息学分析,构建pET41a-EgMKK1、pET41a-Eg14-3-3原核表达质粒,经诱导、表达并纯化重组rEgMKK1、rEg14-3-3 蛋白,Western Blot 检测 rEgMKK1、rEg14-3-3 重组蛋白生物学特性,为进一步研究该基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础。构建细粒棘球幼(Eg)14-3-3与MKK2酵母双杂交系统,并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测。方法:设计EgMKK1、Eg14-3-3基因特异性引物,从新疆株细粒棘球蚴原头蚴中提取总RNA,mRNA反转录生成cDNA,以cDNA为模板PCR法扩增EgMKK1、Eg14-3-3 基因,构建 pMD19-T/EgMKK1、pMD19-T/Eg14-3-3 质粒,测序确定序列并进行生物信息学分析。构建Pet41a-EgMKK1、Pet41a-Eg14-3-3原核表达质粒,测序鉴定插入序列正确性。IPTG诱导表达rEgMKK1-His、rEg14-3-3-His重组蛋白,Ni-NTAHis Bind Resin亲合层析柱纯化或者Kcl染色切胶纯化,SDS-PAGE法确定蛋白表达情况,Western Blot检测其生物学功能。扩增Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列,将其克隆入酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中。结果:PCR扩增出一条长度约1000bp的条带,测序结果显示其长度为1017bp,编码338个氨基酸,为一新基因,命名为EgMKK1(GenBank:JN573355.1),蛋白等电点为6.47。PCR扩增出一条基因Eg14-3-3长度约750 bp的条带,测序结果显示其长度为742bp,编码246个氨基酸,PI为4.80,与Em14-3-3同源性为97.30%.;PCR扩增出EgMKK2基因编码区全长1 572 bp。EgMKK1与多房棘球绦虫EmMEK1基因同源性比较表明同源性为98.70%。成功构建了 Pet41a-EgMKK1、Pet41a-Eg14-3-3原核表达质粒,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明rEgMKK1-His、rEg14-3-3-His重组蛋白得到成功表达,在相对分子量73KDa和58KDa处有表达条带;Western Blot分析显示rEgMKK1-His、rEg14-3-3-His重组蛋白能被特异性抗人MKK3/6、人14-3-3单克隆抗体识别。构建的pGBKT7-Eg14-3-3及pGADT7-EgMKK2重组质粒转化到酵母细胞Y2HGold中,检测表达蛋白对Y2HGold无毒性及自激活作用。结论:首次克隆细粒棘球蚴EgMKK1、Eg14-3-3基因,成功构建高效融合表达基因工程菌株pET41a-EgMKK1、Eg14-3-3,成功诱导表达并纯化EgMKK1、Eg14-3-3重组蛋白,发现EgMKK1重组蛋白具有与MKK3/6抗体结合的功能,而重组蛋白Eg14-3-3可以与CE病人血清特异性结合。为进一步研究EgMKK1、Eg14-3-3基因在寄生虫与宿主相互作用中的功能奠定基础,同时为进一步运用酵母双杂交技术筛选与Eg14-3-3、EgMKK2相互作用的蛋白奠定了基础。