囊泡型ATP酶(Vacuolar ATPase,V-ATPase)是破骨细胞发挥正常生理功能的关键分子,能够为破骨细胞进行骨吸收提供必要的酸性环境。ATP6V1H基因编码多亚基蛋白复合体V-ATP酶的重要调控亚基,即H亚基。我们课题组在前期研究工作中发现一个遗传病家系,其临床表现为全身性骨骼的病理变化,我们从该家系中检测出了ATP6V1H基因的错义突变。目前该基因对骨代谢平衡调控研究尚未有明确报道,因此本研究在课题组前期工作的基础之上,观察了ATP6V1H在骨组织中的定位,发现其在破骨细胞有特异性表达。我们应用CRISPR/Cas9技术构建了Atp6v1h基因敲除小鼠,检测了Atp6v1h+/-小鼠骨密度的变化,在体外对比了该小鼠与野生型小鼠破骨细胞形成差异,并初步探索了ATP6V1H基因参与调控破骨细胞功能的机制。实验方法:1.取3月龄野生型雄性小鼠股骨胫骨,固定后石蜡包埋。将连续相邻两张石蜡切片分别进行ATP6V1H免疫组化和破骨细胞特异的TRAP染色,观察ATP6V1H在小鼠骨组织中的定位。2.采用CRISPR/Cas9技术构建Atp6v1h基因敲除小鼠,测序鉴定小鼠基因型,发现仅Atp6v1h+/-杂合基因型小鼠能够存活。获取野生型与Atp6v1h+/-两种基因型小鼠的股骨组织(同窝3月龄雄性小鼠),固定后用活体小动物CT(Micro-CT)扫描股骨密度,分析两种基因型小鼠的骨密度差异。3.获取野生型与Atp6v1h+/-两种基因型小鼠胫骨骨髓细胞,用双因子(M-CSF和RANKL)诱导破骨细胞的形成。采用不同浓度RANKL诱导实验,观察RANKL浓度对这两种基因型破骨细胞的诱导是否存在差异。TRAP染色观察这两种基因型破骨细胞的形态大小等一般生物学特征,并使用骨片吸收实验验证两种基因型破骨细胞的骨吸收能力差异。4.应用免疫组化染色方法检测ATP6V1H在小鼠胰腺组织的表达定位。高脂饮食喂养两种基因型的小鼠,对比其在空腹血糖、血清胰岛素浓度、糖耐量、胰岛素耐量的差异。通过体外细胞实验,观察血糖和胰岛素浓度对Atp6v1h+/-小鼠破骨细胞数目的影响。结果:1.免疫组化显示ATP6V1H在骨组织的定位与TRAP染色阳性的破骨细胞重合,说明ATP6V1H在小鼠骨组织的破骨细胞中有表达。2.Micro-CT结果显示Atp6v1h+/-小鼠股骨密度较野生型小鼠显著降低,与野生型相比,Atp6v1h+/-小鼠的BV/TV、Tb.Th和Ct.Th分别降低,而BS/TV升高,n=8,P<0.01。3.采用30 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml浓度的RANKL诱导原代骨髓细胞分化形成原代破骨细胞,发现在30 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml浓度下,Atp6v1h+/-小鼠诱导的原代破骨细胞数目均少于野生型,说明两种基因型小鼠的破骨细胞都能够响应RANKL诱导,且有一定的剂量效应,但Atp6v1h+/-小鼠对RANKL的响应相对较弱。统计破骨细胞数目发现Atp6v1h+/小鼠破骨细胞数目较野生型减少51.8%(P<0.01)。骨吸收实验显示Atp6v1h+/-小鼠破骨细胞的骨吸收能力较野生型显著下降,Atp6v1h+/-小鼠破骨细胞骨吸收陷窝面积平均减少24.7%(P<0.01)。4.ATP6V1H特异地表达于胰腺组织的胰岛中,而Atp6v1h+/-小鼠胰岛中ATP6V1H的表达显著降低。野生型与Atp6v1h+/-两种基因型小鼠的空腹血糖无明显差异,但Atp6v1h+/-小鼠的血清胰岛素浓度比野生型下降10.2%(P<0.01),且糖耐量有明显下降;高脂喂养后,Atp6v1h+/-小鼠空腹血糖比野生型升高21.5%,血清胰岛素浓度比野生型下降30.5%(P<0.01),糖耐量亦有明显下降。5.高糖培养时,在低浓度胰岛素(0 nmol/L、1 nmol/L、2 nmol/L、5nmol/L、10nmol/L)范围内,野生型Atp6v1h+/+小鼠破骨细胞数目随胰岛素浓度升高而明显增加,但杂合型小鼠破骨细胞的数目不随胰岛素浓度的改变产生变化;低糖培养时,两种基因型小鼠的破骨细胞不受胰岛素的影响;且不论是低糖还是高糖培养,高浓度胰岛素(50nmol/L、100 nmol/L)对小鼠破骨细胞的生成都有明显的抑制作用。结论:1.ATP6V1H表达于小鼠股骨的破骨细胞中,且其表达剂量不足时小鼠骨骼密度明显降低;2.ATP6V1H可以影响体外培养小鼠破骨细胞的形成,Atp6v1h基因的部分缺失会损害破骨细胞的骨吸收功能;3.ATP6V1H定位于胰腺组织的胰岛中,可能参与了胰岛素的分泌;4.ATP6V1H剂量不足会干扰破骨细胞对胰岛素的敏感性。本课题通过对Atp6v1h基因敲除小鼠的体内和体外细胞学研究,明确了ATP6V1H在骨组织的定位,证实了ATP6V1H参与破骨细胞骨吸收功能的调控过程,并且发现ATP6V1H在胰岛组织的特异表达及其对小鼠破骨细胞胰岛素敏感性的影响,为ATP6V1H参与调控破骨细胞骨吸收功能的机制探索提供了一定的实验依据,对骨密度变化相关疾病的发生机制提供了可靠的研究基础,为临床治疗和药物设计提供了新的靶点,具有十分重要的研究意义。