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目的:维生素D一方面通过肠和肾间接调节骨稳态,另一方面作用于骨相关细胞直接调节骨代谢,在维持骨骼发育和骨骼稳态中起着重要作用。尽管维生素D已被广泛研究,但维生素D对成骨细胞的直接作用尚不清楚。本研究的目的是鉴定小鼠成骨细胞中1,25（OH）2D3的作用蛋白,并分析1,25（OH）2D3/VDR和相关蛋白质在骨代谢中的作用及机制。研究方法:本研究一共分为三个部分。第一部分小鼠成骨细胞1,25（OH）2D3作用蛋白的鉴定与分析将小鼠成骨细胞系MC3T3-E1分别用活性维生素D（1,25（OH）2D3）和酒精对照处理后,进行TMT实验,以鉴定这些细胞中差异表达的蛋白质,将这些差异蛋白进行生物信息学分析。筛选出有意义的差异表达蛋白进行Western blot验证与分析。第二部分胚胎小鼠股骨中MRC2的表达以及小鼠成骨细胞中1,25（OH）2D3/VDR与MRC2的作用关系在胚胎小鼠股骨中,利用免疫组织化学定位MRC2的表达并分析随着胎龄的变化股骨中MRC2的表达变化趋势;在缺乏活性维生素D的模型小鼠（Cyp27b1敲除小鼠）股骨中分析了MRC2的表达变化;在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中分别通过转染腺病毒过表达VDR和转染Vdr siRNA干扰VDR的表达后给予1,25（OH）2D3处理,检测MRC2的表达变化,分析1,25（OH）2D3/VDR与MRC2的作用关系;利用双荧光素酶报告基因实验分析了Vdr与Mrc2启动子区域的结合活性;第三部分在小鼠成骨细胞中1,25（OH）2D3/VDR/MRC2对胶原代谢的影响在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中,Mrc2 siRNA干扰MRC2的表达,分析成骨细胞胶原代谢的变化;PRM法定量分析1,25（OH）2D3对成骨细胞胶原蛋白表达的影响;结合生物信息学和PRM的分析结果,在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中,调节MRC2的表达,探索MRC2下游的胶原相关蛋白,并探讨MRC2与胶原相关蛋白的作用机制。结果:第一部分小鼠成骨细胞1,25（OH）2D3作用蛋白的鉴定与分析1.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中,有150种蛋白响应于1,25（OH）2D3表达显著上调,129种蛋白质表达显著下调;2.Protein binding等分子功能,single organism process等生物学过程以及PI3K–Akt signaling pathway等通路的蛋白质发生了显著性变化,许多胶原相关蛋白高度互相连接。3.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中,三种与骨代谢相关的蛋白质（MRC2,WWTR1和RASSF2）在1,25（OH）2D3处理后的表达显著上调;4.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中,MRC2的上调呈1,25（OH）2D3剂量依赖性。第二部分胚胎小鼠股骨中MRC2的表达以及小鼠成骨细胞中1,25（OH）2D3/VDR与MRC2的作用关系1.胚胎小鼠股骨中MRC2主要在生长板肥大细胞区、骨形成区及骨化区域显著表达;2.在活性维生素D缺乏的模型小鼠（Cyp27b1敲除小鼠）的股骨组织中,MRC2表达显著下调;3.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中,干扰VDR的表达后,1,25（OH）2D3对MRC2的上调作用消失;4.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中,过表达VDR以后,1,25（OH）2D3对MRC2的上调作用显著提高;5.1,25（OH）2D3/VDR并非通过转录激活机制上调MRC2的表达。第三部分在小鼠成骨细胞中1,25（OH）2D3/VDR/MRC2对胶原代谢的影响1.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中,干扰MRC2的表达后,细胞外基质胶原蛋白含量增加;2.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中,1,25（OH）2D3可显著下调COL5A2和COL12A1蛋白的表达;3.在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中干扰MRC2后COL5A2表达上调,MRC2和COL5A2存在蛋白相互作用;4.MRC2和MMP13在胎鼠股骨组织中蛋白水平共定位表达,在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中干扰MRC2后MMP13表达上调,且MRC2和MMP13存在蛋白相互作用。结论:1.1,25（OH）2D3可上调成骨细胞中骨相关蛋白MRC2、WWTR1和RASSF2的表达;在小鼠成骨细胞中MRC2上调呈1,25（OH）2D3剂量依赖性。2.体内缺乏1,25（OH）2D3的Cyp27b1基因敲除鼠股骨组织MRC2表达下降。3.1,25（OH）2D3上调成骨MRC2的表达依赖于VDR的存在,但MRC2的上调并非通过VDR的转录激活作用实现;4.1,25（OH）2D3/VDR通过MRC2直接调节骨胶原摄取;5.1,25（OH）2D3/VDR/MRC2作用于COL5A2负向调节骨胶原纤维的形成;6.1,25（OH）2D3/VDR/MRC2作用于MMP13参与骨基质胶原的分解代谢。