【摘 要】
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目的：本实验选择cdh5为目的基因,观察cdh5基因在过表达HoxB4基因的特异性转基因斑马鱼系胚胎期造血发育过程中的表达情况,以探讨cdh5基因与HoxB4基因调控造血发育可能的作用机
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目的：本实验选择cdh5为目的基因,观察cdh5基因在过表达HoxB4基因的特异性转基因斑马鱼系胚胎期造血发育过程中的表达情况,以探讨cdh5基因与HoxB4基因调控造血发育可能的作用机制。 方法：收集0.75-120hpf之间多个时相的野生型斑马鱼胚胎,TRIZOL法提取总RNA后,通过RT-PCR扩增cdh5基因片段,将目的片段与载体pCS2+连接,构建cdh5-pCS2+重组质粒,以T7RNA聚合酶体外转录制备反义mRNA探针,通过斑马鱼全胚胎原位杂交技术及灰度分析检测cdh5基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况,以及在HoxB4实验组(TG:zLmo2-LDeL-HoxB4-EGFP;TG:zLmo2-Cre)及EGFP对照组(TG:zLmo2-LDeL-EGFP;TG:zLmo2-Cre)斑马鱼胚胎早期发育过程中表达变化情况。 结果：成功构建了cdh5-pCS2+重组质粒,制备了反义mRNA探针,原位杂交结果示野生型斑马鱼3.7hpf的胚胎即有cdh5基因的阳性杂交信号,而18至36hpf的胚胎cdh5基因在造血组织中间细胞群(ICM)、主动脉-性腺-中肾区(AGM)、后部血岛(PBI)、躯干大血管的血管内皮细胞及脑部组织中表达,30hpf达到高峰,至36hpf明显下降。48至72hpf仅在脑部有少量表达,主要的造血部位未观察到明显的阳性杂交信号。HoxB4实验组、EGFP实验对照组及野生型对照组胚胎中,18-40hpf均可观察到实验组cdh5基因在造血组织中的表达均较对照组明显增多,即过表达HoxB4基因时,cdh5基因的表达也是增加的。44hpf以后cdh5基因在造血组织中的表达差异不明显。 结论：初步了解cdh5基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况,发现过表达HoxB4的转基因斑马鱼胚胎在造血干细胞增殖明显的情况下,cdh5基因的表达量明显增加,并且这种表达增加只发生在原始及定向造血期,定向造血后其表达逐渐下降至消失,提示cdh5基因可能作为HoxB4的协同或下游靶基因,参与了在HoxB4基因调控的斑马鱼胚胎早期造血干细胞自我修复及增殖分化过程。
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