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临床报告亚砷酸钠（NaAsO2）对肝癌等实体肿瘤的疗效较好,但有毒副作用。研究表明黄芪甲苷（AS-Ⅳ）具有抗癌、抗氧化应激、提升免疫力、保护肝脏等表现。本试验假设NaAsO2联合AS-Ⅳ或能产生协同抑癌的作用。鉴于PI3K/AKT/mTOR信号通路在肝癌等多种肿瘤中被激活,且与细胞增殖、凋亡、分化及自噬有关。论文拟通过HepG2细胞和裸鼠肝癌模型,运用毒理学、组织形态学和分子生物学等方法,以PI3K/AKT/mTOR信号通路及关键调控点为切入点,从体内外多层面（机体、组织、细胞、蛋白、基因水平）系统探究NaAsO2联合AS-Ⅳ的协同抗肝癌作用。第一部分NaAsO2和AS-Ⅳ最佳有效浓度的筛选及其抑制HepG2细胞增殖的转录组学研究（1）采用NaAsO2和AS-Ⅳ处理HepG2细胞,设置0.078、0.156、0.312、0.625和1.250μg/m L五个浓度,作用HepG2细胞24、48、72、96 h,筛选出了NaAsO2的最佳浓度为0.5μg/m L,AS-Ⅳ的最佳浓度为0.8μg/m L,药物联合组采用0.5μg/m L NaAsO2+0.8μg/m L AS-Ⅳ进行研究,时间为72 h。（2）不同处理组（药物组）与对照组基因表达差异分析结果显示,下调基因数量明显高于上调基因,表明NaAsO2和AS-Ⅳ对基因的影响以下调为主,且组间共同表达差异基因为181个,提示不同处理间可能存在共同的作用途径。所有处理组以多细胞生物过程调控、发育过程调控、解剖结构发育等参与生物过程的基因最多。所有处理组富集的集中作用通路主要有细胞因子-细胞因子受体相互作用、铁死亡、造血细胞系、雌激素信号通路等,并在组间还发现PI3K-AKT、FOXO、c AMP、MAPK等多条信号通路均存在显著差异（P<0.05）,提示NaAsO2与AS-Ⅳ主要通过调控癌症相关信号通路发挥抗肝癌作用。第二部分NaAsO2和AS-Ⅳ抑制HepG2肝癌细胞增殖的体外研究（1）本研究采用CCK8法、划痕试验、Transwell试验检测了在NaAsO2和AS-Ⅳ单独及联合使用下HepG2细胞的活性及迁移侵袭能力。除划痕试验显示仅NaAsO2+AS-Ⅳ组细胞迁移能力降低外（P<0.05）,其余试验均显示NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组细胞增殖率、迁移侵袭能力显著下降（P<0.05）,其中NaAsO2+AS-Ⅳ组最为显著,在GNGT1siRNA组,HepG2细胞增殖率升高,迁移侵袭能力增强（P<0.05）。（2）采用流式细胞术检测NaAsO2和AS-Ⅳ单独及联合对HepG2细胞周期及凋亡的影响。结果显示:NaAsO2组、NaAsO2+AS-Ⅳ组及GNGT1siRNA组G0/G1期细胞所占百分比均显著降低（P<0.05）;NaAsO2组、AS-Ⅳ组、NaAsO2+AS-Ⅳ组及GNGT1 siRNA组S期细胞所占百分比均显著增高（P<0.05）。NaAsO2组、AS-Ⅳ组、NaAsO2+AS-Ⅳ组诱导细胞凋亡作用均显著升高（P<0.01）,NaAsO2与AS-Ⅳ联用诱导细胞凋亡的作用显著高于NaAsO2和AS-Ⅳ单独使用（P<0.01）,且NaAsO2诱导细胞凋亡的作用显著高于AS-Ⅳ（P<0.01）。（3）在体外采用免疫荧光、Real time PCR和Western Blot法检测NaAsO2和AS-Ⅳ对PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）的影响。结果显示:GNGT1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR在HepG2细胞中均有表达。各药物组GNGT1 m RNA表达量均显著升高（P<0.05）,GNGT1 siRNA组GNGT1 m RNA和蛋白表达量均显著降低（P<0.05）。从整体上看,经NaAsO2和AS-Ⅳ单独及联合处理后,各组细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达量明显下降,在抑制上游基因GNGT1后,以上基因蛋白表达均显著升高（P<0.05）,提示GNGT1可能参与了对PI3K/AKT/mTOR通路的调控。从各药物组对目的基因、蛋白的影响看,以NaAsO2+AS-Ⅳ组调控变化最为显著（P<0.05）,呈现出NaAsO2+AS-Ⅳ组>NaAsO2组>AS-Ⅳ组的结果。第三部分NaAsO2和AS-Ⅳ抗肝癌作用的体内研究（1）建立裸鼠肝癌移植瘤模型,分为对照组（即模型组,给予等量生理盐水）、NaAsO2组（30 mg/kg）、AS-Ⅳ组（30 mg/kg）、NaAsO2+AS-Ⅳ组（各15 mg/kg）,给药频率次/3 d,持续25 d。结果显示裸鼠体重无显著变化,而NaAsO2+AS-Ⅳ组瘤体积在第16 d显著减小（P<0.05）,NaAsO2组、AS-Ⅳ组及NaAsO2+AS-Ⅳ组瘤体积在第19 d均显著减小（P<0.05）。（2）采用ELISA法检测了不同处理对裸鼠血清肿瘤标志物AFP、DCP、CEA和TNF-α的影响,结果显示:NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组血清AFP、DCP、TNF-α含量均显著低于对照组（P<0.05）;AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组血清CEA含量均显著降低（P<0.05）。以上指标在NaAsO2+AS-Ⅳ组降低最为显著（P<0.05）。（3）采用HE和TUNEL染色法观察NaAsO2和AS-Ⅳ对裸鼠肝癌移植瘤的病理组织学影响,结果表明NaAsO2+AS-Ⅳ组的肿瘤细胞核固缩及细胞凋亡最为明显。（4）在体内采用Real time PCR和Western Blot法检测NaAsO2和AS-Ⅳ对PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白的影响,结果显示:NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组PI3K、AKT和mTOR m RNA表达量均显著低于对照组（P<0.05）,其中NaAsO2+AS-Ⅳ组表达量最低。NaAsO2+AS-Ⅳ组PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-mTOR蛋白表达量均显著低于对照组（P<0.05）;NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组GNGT1 m RNA表达量均显著高于对照组（P<0.05）。本研究采用祛邪与扶正中药联合方案进行抗肝癌研究,结果表明NaAsO2与AS-Ⅳ均具有抗肝癌作用。体外研究显示出NaAsO2与AS-Ⅳ联用抑制HepG2细胞的作用显著高于二者单独使用,初步表明二者具有协同抗肝癌作用。体内研究显示低剂量NaAsO2与低剂量AS-Ⅳ联合的抗肝癌作用仍优于其高剂量单独使用,进一步表明二者具有协同抗肝癌作用。PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）与致癌性密切相关,体内外研究结果均显示NaAsO2与AS-Ⅳ下调了其表达,表明NaAsO2与AS-Ⅳ可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗肝癌作用,且NaAsO2与AS-Ⅳ联用对目的基因、蛋白的调控作用更为显著,从分子水平表明NaAsO2与AS-Ⅳ存在协同抗肝癌作用,同时提示PI3K、AKT和mTOR可以作为抗肝癌药物的治疗靶点。