第一部分WAS蛋白缺陷对生发中心B细胞突触结构和功能的影响和机制研究背景:B细胞在生发中心经历体细胞高频突变（SHM）和亲和力成熟。高频突变的生发中心B（GCB）细胞竞争性结合滤泡树突状细胞（FDC）表面提呈的抗原。近期研究显示,GCB细胞受膜抗原刺激时,可生成BCR微簇聚集且富含肌动蛋白的pod-like结构帮助细胞进行亲和力辨别。肌动蛋白调节因子如WAS蛋白的缺陷可致B细胞亲和力成熟障碍,而肌动蛋白调节GCB细胞的BCR信号传导机制尚且不明。目的:阐明生发中心B细胞活化时免疫突触特点,探索WAS蛋白如何参与调节生发中心B细胞活化及免疫突触结构的形成和维持。方法:用绵羊红细胞（SRBC）免疫表达有Lifeact-GFP的WT/WKO小鼠,体外磁珠分选生发中心B细胞（GCB）,用全内反射荧光显微镜（TIRF）活细胞成像技术观察GCB细胞与抗原标记的脂质双分子层（Fab’-PLB）接触和反应的过程,且观察免疫突触及BCR信号的特点。结果:GCB细胞在Fab’-PLB上展开后,各BCR信号分子在细胞接触面分布有所不同,CD79a、Syk和SHP1在突触中央区及细胞边缘均有磷酸化信号聚集,SHIP1磷酸化信号主要聚集在细胞边缘,而AKT磷酸化信号散在分布。这些信号聚集与富含肌动蛋白的胞膜突出结构共定位。WAS蛋白缺陷致肌动蛋白foci的形成和稳定性受限,继而影响了GCB细胞胞膜突出结构的形成和突触中央区BCR信号微簇的形成及生长。WKO GCB细胞边缘区的肌动蛋白foci形成减少,且规律性降低,影响了细胞在膜抗原表面的展开和抗原获取。结论:GCB细胞活化时可形成独特的免疫突触结构,促进细胞获取抗原和BCR信号激活,而这一结构的形成和维持需要WAS蛋白的调节。第二部分WAS蛋白缺陷对生发中心B细胞选择及细胞活性的影响和机制研究背景:WAS蛋白缺陷可导致严重的免疫失调。WAS病人接受疫苗后产生抗体反应减弱并伴有自身免疫性抗体生成。WAS蛋白缺陷的B细胞可形成自发性生发中心且在无正常T细胞辅助时仍可生成类别转换的自身抗体。我们前期发现WAS病人和WKO小鼠中抗原特异性Ig G生成水平及其亲和力较正常样本均显著降低。目的:研究WAS蛋白调节生发中心B（GCB）细胞对第一信号和第二信号的反应以及其维持细胞扩张的调节机制。方法:用绵羊红细胞（SRBC）免疫WT/WKO小鼠,利用流式细胞术分步检测GCB细胞内化抗原,处理并将抗原与MHC-II分子组装后表达在膜表面以及其与T细胞共轭结合的能力。除此外,检测GCB细胞的活性和活性相关调节因子,且利用免疫荧光成像和透射电镜技术检测GCB细胞内线粒体形态。结果:WKO小鼠中GCB占B细胞的百分比和血清总Ig G水平正常,但其抗原特异性SRBC-Ig G生成减少。GCB细胞内化可溶性抗原的效率在WT和WKO样本中未见差异。但WKO GCB细胞活化后的BCR信号通路中正向调节分子p CD79a水平减少而负向调节分子p SHIP1水平稍强。WKOGCB细胞内化抗原后,在胞内将抗原与MHC-II分子组装并表达在膜表面的能力降低。在OVA肽段预处理后,WKOGCB细胞与OT-IICD4+T细胞共轭结合的能力较WT细胞显著降低。除此外,WKO GCB细胞中明区细胞占比减少,表面ICAM-1表达减少。但WKO GCB细胞活性明显高于WT细胞,这可能与胞内产生活性氧水平及Mito Tracker荧光水平减少相关。免疫荧光及电镜检测线粒体均发现WKO GCB细胞内线粒体最大直径偏长,与WT细胞比较有形态学改变。免疫荧光检测发现,线粒体分裂相关蛋白DRP1的簇状信号和肌动蛋白foci在WKO GCB细胞中明显减少,而两者与线粒体的共定位也较WT细胞更弱。结论:WAS蛋白既可促进B细胞在生发中心获取抗原,激活BCR信号,获得T细胞的帮助继而激活抗原特异性GCB细胞,也可通过调节线粒体形态和功能促进非特异性GCB细胞的死亡。