目的:炎症导致骨吸收增加和骨形成受损,炎症反应的程度与局部和全身性骨丢失的程度密切相关。白介素-6（interleukin-6,IL-6）是炎性介质网络的关键成分,在骨代谢中发挥着重要作用。烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt）是一个多功能蛋白,研究发现,Nampt调控干细胞成骨分化,具有决定成骨细胞谱系命运的作用;同时,Nampt在多种炎症相关疾病中表达上升,被认为是固有免疫反应的中介物质。在炎性环境中,Nampt对成骨分化和和炎症反应的调控作用尚不清楚。因此,明确Nampt在炎性环境中,调控成骨分化和炎症反应的机制,为治疗炎症性骨丢失提供新的思路。方法:本研究以小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,（1）首先通过脂多糖（LPS）体外诱导MC3T3-E1细胞,建立前成骨细胞的炎症反应模型,通过RT-q PCR和ELISA检测细胞分泌促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的情况,通过CCK-8、ALP染色和ALP生化定量,观察炎性环境下,成骨细胞受抑制的情况,并通过western blot确定不同LPS浓度刺激下Nampt的表达量,筛选出合适的LPS诱导浓度。（2）然后采用成骨诱导基质培养细胞0、3、6、9、12d,通过ALP染色、RT-q PCR和western blot,明确Nampt是否随着细胞成骨诱导分化时间的延长而表达增加。接下来,使用抑制剂FK866抑制Nampt活性,通过NAD+/NADH分析、ELISA、免疫荧光、western blot等实验,明确抑制Nampt表达对成骨分化和炎症反应的下调作用。之后,利用腺病毒基因沉默或过表达Nampt基因,通过RT-q PCR和western blot验证敲低和过表达效率,及对成骨分化的调控作用。再在LPS诱导的情况下,调控Nampt表达,通过RT-q PCR、ELISA、western blot、细胞免疫荧光等技术,检测IL-6分泌、NF-κB信号通路关键蛋白表达情况、及对成骨分化标志物表达的影响。下一步,利用抑制剂和激动剂改变Nampt-NAD+/Sirt1回路中的关键蛋白Sirt1的表达,观察IL-6分泌、NF-κB信号通路关键蛋白表达情况、及对成骨分化标志物表达的影响,从而揭示在LPS诱导的炎性环境下,Nampt对前成骨细胞成骨分化和炎性反应的调控作用及机制。（3）最后,采用腺病毒转染前成骨细胞系MC3T3-E1细胞,注射入裸鼠皮下,同时向包块注射生理盐水或100ng/m L LPS,观察4w。通过骨组织切片化学染色与免疫组织化学染色,验证Nampt的体内促成骨作用。结果:（1）采用0～1000ng/m L的LPS诱导MC3T3-E1细胞,当LPS浓度>100ng/m L时可明显抑制细胞增殖,使细胞ALP染色减弱、活性降低。LPS浓度越高,抑制作用越明显。RT-q PCR和ELISA检测到LPS诱导细胞分泌IL-6,未检测出IL-1β和TNF-α分泌。LPS诱导使Nampt表达增高,100ng/m L的诱导浓度下,Nampt和IL-6表达增高最明显（P<0.01）,将该浓度用于后续试验。（2）随着成骨诱导分化时间延长,Nampt表达上升（P<0.01）。Nampt抑制剂FK866抑制细胞成骨分化,减少NF-κB活化。腺病毒sh-Nampt、ad-Nampt及阴性对照sh-con、ad-con以MOI=300转染细胞,48h后可见明显的绿色荧光。未转染病毒组和转染空载病毒组细胞的Nampt表达无明显差异（P>0.05）,Nampt基因沉默使Nampt的蛋白表达水平下降至40%左右,Nampt过表达则使Nampt的蛋白表达上调至2倍左右,Nampt基因沉默及过表达的前成骨细胞模型构建成功。下调Nampt表达降低了成骨分化标志物ALP、Runx2、Col1a1和OCN的表达（P<0.01）,而Sirt1表达增加（P<0.01）;过表达Nampt增加了成骨分化标志物的表达（P<0.01）,Sirt1表达下降（P<0.05）。（3）用含或不含100ng/m L LPS的培养基诱导细胞,同时沉默和过表达Nampt。Nampt、Sirt1、IL-6和TAK1在LPS诱导组表达明显增加,NF-κB p65磷酸化水平上升（P<0.01）;Nampt沉默后,IL-6、Nampt和TAK1的表达下降,NF-κB p65的磷酸化水平下降（P<0.05）,而Sirt1表达进一步增加（P<0.01）;Nampt过表达后,IL-6、Nampt和TAK1的表达增加,NF-κB p65的磷酸化水平增加（P<0.05）。细胞免疫荧光显示,LPS促进NF-κB p65向细胞核内转移,Nampt过表达进一步促进了NF-κB p65的核转位,而Nampt基因沉默抑制了NF-κB p65的核转位。在LPS诱导的炎性环境下,Nampt基因沉默使成骨分化标志物ALP、Runx2、Col1a1和OCN的表达进一步下降（P<0.01）,细胞成骨分化明显受抑。Nampt过表达对成骨分化的促进作用超越了Nampt活化NF-κB信号通路对成骨分化的抑制作用,补救了LPS刺激造成的成骨分化抑制。（4）采用Sirt1的特异性抑制剂EX527与100ng/m L LPS共同培养细胞,转染空载病毒的阴性对照组和Nampt基因沉默组的Sirt1m RNA和蛋白表达均降低（P<0.01）,免疫荧光强度明显减弱。EX527降低了NF-κB信号通路中的关键蛋白NF-κB p65的磷酸化水平,IL-6分泌下降;成骨分化标志物ALP、Runx2、Col1a1和OCN的表达也下降（P<0.05）,成骨分化受到抑制。使用NAD+前体NMN（100μM）或Sirt1激动剂SRT1720（5μM）与100ng/m L LPS培养细胞,发现NMN增加了Sirt1和Col1a1的蛋白表达;SRT1720促进了p-NF-κB p65、Runx2、Col1a1和OCN的蛋白表达,NMN和SRT1720补救了LPS对成骨分化的抑制作用。（5）体内实验共分为4组,包括:ad-con+NS组、ad-Nampt+NS组、ad-con+LPS组和ad-Nampt+NS组。H&E染色和Masson三色染色显示4组均有骨形成,可见ad-Nampt+NS组骨块中大量未成熟骨小梁和蓝染胶原组织;ad-con+NS组和ad-Nampt+LPS组也可见到较多蓝染胶原组织;ad-con+LPS仅见少量胶原组织形成。茜素红染色显示红色钙化基质,ad-Nampt+NS组的成骨细胞矿化结节最多,其次为ad-con+NS组和ad-Nampt+LPS组,ad-con+LPS组的矿化结节最少。ad-Nampt+NS组和ad-Nampt+LPS组的Runx2、Col1a1和OCN表达均明显高于ad-con+NS组和ad-con+LPS组,说明在非炎性环境和LPS刺激造成的炎性环境下,Nampt都具有促进体内成骨分化的效应。Nampt过表达补救了LPS刺激造成的成骨分化受抑制的现象。结论:（1）LPS刺激小鼠前成骨细胞的NF-κB信号通路活化,分泌IL-6,使Nampt和Sirt1表达增加,细胞增殖和成骨分化受到抑制。（2）在LPS诱导的炎性环境中,Nampt和Sirt1同时参与前成骨细胞的NF-κB活化和成骨分化过程,二者产生叠加作用;增加Nampt和Sirt1表达可以补救LPS对成骨分化的抑制作用。（3）在裸鼠皮下异位成骨中,LPS抑制成骨细胞分化、胶原产生、骨基质矿化和骨小梁形成,Nampt促进成骨细胞分化、胶原产生、骨基质矿化和骨小梁形成,Nampt过表达可以补救LPS对成骨分化的抑制作用。