水体富营养化是全球十大环境问题之一,氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。为解决磷污染所带来的危害,在污水进入水体前进行有效处理,降低排放污水的磷浓度十分必要。强化生物除磷工艺(Enhancedbiological phosphorus removal,EBPR)是目前世界各国普遍使用的方法,该工艺具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特点。EBPR系统中聚磷茵在磷的去除过程中起着至关重要的作用。为此,加大对聚磷菌的聚磷特性、聚磷相关基因及聚磷菌的工程化应用进行研究十分必要。本文以高效聚磷菌聚磷机理研究为主线,以一株高效聚磷茵GM6为研究材料,一方面系统研究了ppk1编码的多聚磷酸盐激酶被敲除后对菌体生理生化性质的影响,另一方面通过强化表达ppk1编码的多聚磷酸盐激酶和PHA操纵元(phaC1-phaZ-phaC2)构建了两株高效除磷工程菌并结合本实验室已获得的phaZ突变株对EBPR系统中碳磷循环代谢进行研究。1.ppk1突变对Pseudomonas putida GM6特性的影响及ppk2基因的克隆ppk基因编码多聚磷酸盐激酶,主要负责多聚磷酸盐(Poly-P)的合成。大多数微生物体内编码PPK的基因都有ppk1和ppk2两类。通过同源重组敲除ppk1后,突变株在菌体形态,生理生化等方面发生显著变化:通过扫描电镜观察发现突变株较之原始菌株表面粗糙有凹凸不平感,且部分细胞一端或两端同时有凹陷,生长速度变慢,代时增加25%,生物膜形成能力下降50%,游动性与抗逆能力与原始菌株相比显著降低,这都可能是由于菌体多聚磷酸盐激酶活性的丧失,使细胞内Poly-P水平降低或是Poly-P链长组成发生变化,从而引发细胞功能的降低或缺失。而突变株与原始菌株相比在除磷能力上并没有显著变化,这可能是由于GM6中还存在着另一个编码多聚磷酸盐激酶的基因(ppk2)。根据种属间的同源性,利用快速染色体步移方法克隆了ppk2基因,并将其定向克隆到pET29a载体上进行表达,为进一步研究多聚磷酸盐激酶的功能打下了基础。2.高效聚磷基因工程茵的构建通过PCR方法从高效聚磷菌株GM6总DNA中扩增得到了ppk1、PHA及其自带的启动子,并定向克隆到pBBR1MCS-5载体上,构建了重组质粒pMEPE-PPK和pMEPE-PHA,在辅助质粒pRK2013的帮助下,通过三亲接合将pMEPE-PPK及pMEPE-PHA转移到原始菌株GM6中,获得的工程菌P.putidaGM6-PPK1和GM6-PHA。两株工程菌除磷能力较原始菌株GM6和对照菌株GM6-P5有了显著提高,而且在无抗性条件下质粒稳定,因此有着潜在的应用前景。通过模拟EBPR工艺,发现GM6-PPK1和GM6-PHA在厌氧/好氧交替的环境条件下强化表达不但提高了菌体好氧段的吸磷能力,而且厌氧段磷的释放和PHA的合成较之原始菌株也有显著增加,这说明ppk1和PHA的强化表达,不但增强了菌体的除磷能力,也在一定程度上提升了碳磷循环代谢的能力,使得菌体有更好的除磷和除COD的能力。