第一部分人参皂苷Rf对大鼠子宫内膜异症病灶大小、疼痛及炎症反应的影响研究背景子宫内膜异位症(EM)是子宫内膜出现在子宫腔以外的位置引起的一种雌激素依赖的炎症反应性疾病,影响约10%育龄女性,疼痛是子宫内膜异位症的主要症状之一。因其异位的位置不同疼痛表现多样,如痛经、慢性盆腔疼痛、性交痛,甚至出现功能障碍如排尿困难等。手术和激素治疗是子宫内膜异位症的主要治疗方法。然而术后复发高,5年复发率约50%,疼痛的复发往往早于病灶的发现。而药物治疗主要以激素类药物为主,有相关骨质疏松、肝功能损害等副作用。并且药物治疗对内异症疼痛的疗效并不可靠,随着疼痛的逐渐加重,多数药物作用失效。因此,寻找一种新的有效方法成为治疗子宫内膜异位症的当务之急。子宫内膜异位症疼痛是中枢因素和外周因素共同作用的结果。中枢因素包括中枢敏化、神经突触的重塑、长时程增强效应等机制;而外周因素包括病灶增大对神经末梢的机械性刺激、炎症因子及铁离子对神经末梢的化学性刺激,神经纤维末梢的敏化以及病灶内感觉神经交感神经分布的不平衡等机制。炎症反应在子宫内膜异位症疼痛的发生及恶化的过程中起决定性的作用。炎症因子可以增强内膜细胞增殖、侵袭粘附能力,促进血管的生成,利于内异症的生长和维持。炎症因子还可以诱导神经纤维的生长、刺激神经末梢产生神经冲动,并进一步敏化神经末梢,不仅诱导疼痛的产生,还进-一步导致疼痛的恶化。对机制的深入了解可以帮助我们更加有效的寻找到子宫内膜异位症疼痛的治疗方法。人参皂苷Rf是人参中提取的一种糖苷,是人参止痛作用的主要成分,它在多种体内、体外实验中表现出明显的镇痛作用,如腹痛、牙疼及急性切割痛等。近几年,人们逐渐认识到人参皂苷Rf的抗炎作用。它可以抑制IL-6、IL-1β等炎症因子的产生,抑制炎症通路的激活。而这些炎症因子也参与了子宫内膜异位症的发生发展。因此我们推测人参皂苷Rf可能抑制子宫内膜异位症的疼痛及炎症反应。目前为止还没有有关人参皂苷Rf在子宫内膜异位症疼痛方面的研究,本研究将着重探讨人参皂苷Rf在子宫内膜异位症疼痛及炎症反应中的作用。实验目的:本研究建立了大鼠的腹壁子宫内膜异位症模型,基于对子宫内膜异位症疼痛机制的认识和理解,在病灶体积、疼痛反应及炎症反应三方面观察不同浓度的人参皂苷Rf对大鼠子宫内膜异位症的影响,并进一步探讨人参皂苷Rf影响子宫内膜异位症的作用机制。试验方法:将试验大鼠随机分为正常对照组(sham)、戊酸雌二醇对照组(E2V)、子宫内膜异位症组(model)、人参皂苷Rfl组(Rf1)、人参皂苷Rf2组(Rf2)、人参皂苷Rf4组(Rf4)。model组及人参皂苷Rf组大鼠共70只,首先利用子宫角自身移植法建立大鼠腹壁子宫内膜异位症模型,并于建模后28天采用腹腔探查术进一步确定大鼠腹壁子宫内膜异位症模型的建立,其中58只大鼠建立了子宫内膜异位症模型。未建立模型的大鼠剔除试验。Sham组为正常的wistar大鼠;E2V组为连续给予内异症大鼠0.5 mg/kg的戊酸雌二醇14天诱导的大鼠痛经模型(n=8);model组为连续给予内异症大鼠0.5 mg/kg戊酸雌二醇14天+0.9%NaCI后7天(n=13);Rf治疗组为连续给予内异症大鼠0.5 mg/kg戊酸雌二醇14天+人参皂苷Rf后7天,药物浓度分别为1.0 mg/kg、2.0 mg/kg及4.0 mg/kg(n=15,16及14)。第14天给予戊酸雌二醇后1小时,给予每只大鼠垂体后叶素2U以诱导痛经症状,其后检测:(1)扭体反应频率、持续时间、潜伏时间观察各组大鼠的疼痛反应;(2)测量各组内异症病灶的体积,体积=π/6 ×长×宽×高;(3)Real-time PCR检测前炎症因子 iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-a mRNA 的表达;(4)ELISA检测大鼠腹腔冲洗液VEGF的表达;(5)RT-PCR检测子宫内膜异位症病灶中VEGF mRNA的表达;实验结果:(1)人参皂苷Rf能明显缩小内异症病灶体积,药物浓度越大,抑制作用越明显;Gfl组vs model组:112.80±8.61 vs 121.90±10.32(单位:mm3),P>0.05,差别无统计学意义;Gf2 组 vs model 组:83.11±8.61 vs 121.90±10.32(单位:mm3),P<0.05,差别有统计学意义;Gf4组vs model组:55.79±10.05 vs 121.90±10.32(单位:mm3),P<0.01,差别有统计学意义。(2)人参皂苷Rf能缓解子宫内膜异位症引起的腹痛症状。model组大鼠的扭体反应频率约为E2V组大鼠的2.5倍,持续时间约增加2.1倍,潜伏时间由约7分钟缩短至约2分钟。药物组大鼠的扭体频率及持续时间与model组比较均明显降低,潜伏期明显增加,差别有统计学意义,并且药物浓度越大,作用越明显。(3)人参皂苷Rf能够抑制大鼠子宫内膜异位症的炎症反应。model组大鼠病灶中iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-a炎症因子mRNA表达较sham组明显升高,人参皂苷Rf能够抑制子宫内膜异位症大鼠病灶内炎症因子iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-a mRNA的表达,药物浓度越大抑制作用越明显。(4)人参皂苷Rf抑制子宫内膜异位症VEGF的表达。model组大鼠腹腔冲洗液中VEGF蛋白浓度较sham组明显增高,内异症病灶内VEGF mRNA表达较sham组腹膜组织内VEGF mRNA表达增高。人参皂苷Rf能降低内异症大鼠病灶mRNA表达及腹腔冲洗液中VEGF蛋白浓度,药物浓度越大,作用越显著。实验结论:本实验通过研究人参皂苷Rf对子宫内膜异位症大鼠疼痛、炎症反应、病灶大小的影响,表明人参皂苷Rf能够缓解子宫内膜异位症疼痛、抑制炎症反应,抑制子宫内膜异位症的生长;人参皂苷Rf能够降低腹腔冲洗液中VEGF蛋白表达,抑制内异症病灶内VEGF mRNA的表达,人参皂苷Rf通过抑制VEGF的表达抑制子宫内膜异位症病灶的生长。第二部分人参皂苷Rf对缓解子宫内膜异位症大鼠疼痛及炎症反应机制的研究研究背景子宫内膜异位症是育龄期妇女常见的疾病,发病机制不明,因内膜种植的位置多样,临床症状复杂。疼痛是子宫内膜异位症的主要症状之一。目前对子宫内膜异位症的疼痛的治疗,仍以手术治疗和激素治疗为首选,但治疗过程中存在诸多问题,如复发率高及药物副作用等。人参皂苷Rf是人参皂苷中抑制疼痛的主要有效成分。并且人参皂苷Rf可以通过抑制炎性因子的表达抑制炎症反应,这些炎症因子在子宫内膜异位症中的表达也升高。我们在第一部分的实验中已经证明人参皂苷Rf能够抑制子宫内膜异位症大鼠的疼痛、异位病灶大小及炎症反应,在第二部分的实验中我们将进一步探讨人参皂苷抑制子宫内膜异位症疼痛及炎症反应的分子学机制。BDNF(脑源性神经营养因子)是神经营养因子家族成员,其在神经元的生长、分化及存活方面扮演着重要的角色。它与特异性配体酪氨酸激酶受体B(TrkB)特异性结合发挥各种生理和病理作用。BDNF在多种疼痛的实验模型中表达升高;急、慢性疼痛患者血清BDNF蛋白浓度增高;鞘内注射BDNF的小鼠表现出明显的痛敏反应,这些证据表明BDNF参与疼痛反应,并调控中枢敏化。此外,BDNF在各种急慢性炎症中表达升高,例如骨关节炎及咬肌炎患者血清BDNF水平升高,同时伴随相应神经节内神经元的兴奋性增加,说明BDNF能够通过敏化的神经末梢,兴奋相应的神经元细胞体,参与炎性疼痛反应。BDNF还能调节炎症反应。它能够调节脑中风坏死组织局部的炎症反应,减轻局部的缺血再灌注损伤。BDNF与TrkB特异性结合后,激活下游的ras-MAPK途径,进而进一步使下游的环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)磷酸化,从而调控前炎症因子,如NF-κB的表达。NF-κB进一步调控IL-6及IL-1ββ等炎性因子的表达。而IL-6及IL-1β等炎症因子也参与了子宫内膜异位症的炎症反应。因此我们推测BDNF参与调控子宫内膜异位症疼痛及炎症反应,人参皂苷Rf通过调控BDNF及其信号通路的表达调控子宫内膜异位症的疼痛及炎症反应。我们将在以下实验中进一步证实人参皂苷Rf靶向BDNF-TrkB-CREB信号通路作用于子宫内膜异位症的疼痛及炎症反应。实验目的:探讨人参皂苷Rf对子宫内膜异位症疼痛及炎症反应的作用机制。试验方法:按照第一部分分组及给药方法测定大鼠的疼痛后,取血清、腹腔冲洗液及内异症病灶组织,进行如下试验:(1)ELISA检测大鼠腹腔冲洗液及血清中BDNF表达;(2)RT-PCR检测子宫内膜异位症病灶中BDNF、TrkB及CREB的mRNA表达;(3)Weston blot检测子宫内膜异位症病灶中BDNF、TrkB及pCREB的蛋白表达;实验结果:(1)人参皂苷Rf降低子宫内膜异位症大鼠血清及腹腔冲洗液BDNF蛋白水平。model组大鼠血清及腹腔冲洗液中BDNF蛋白浓度较sham组明显增高,人参皂苷Rf能够降低内异症引起的腹腔冲洗液及血清BDNF蛋白水平的升高,随着药物浓度的升高,BDNF蛋白水平逐渐降低。(2)人参皂苷Rf降低子宫内膜异位症病灶中BDNF、TrkB及CREB mRNA表达。结果显示,model组病灶中BDNF、TrkB及CREB mRNA的表达较sham组均明显升高,BDNF mRNA的表达较sham组增加近3倍,而TrkB mRNA的表达较sham组增加3倍余,CREB mRNA表达增加约2.5倍,P<0.001差别有统计学意义。而人参皂苷Rf能够降低内异症病灶中BDNF、TrkB及CREB mRNA的表达。药物组与model组比较,随着药物浓度的增加,BDNF、TrkB及CREB mRNA的表达逐渐降低,浓度越高,抑制作用越显著。(3)人参皂苷Rf降低子宫内膜异位症病灶中BDNF、TrkB及p-CREB蛋白的表达。结果显示,model组大鼠子宫内膜异位病灶中BDNF、TrkB及p-CREB蛋白的表达较sham组均明显升高,BDNF蛋白的表达较sham组增加近3倍,而TrkB蛋白的表达较sham组增加约2.5倍,p-CREB蛋白表达增加约2.75倍。而人参皂苷Rf能够降低内异症病灶中BDNF、TrkB及p-CREB蛋白表达。药物组与model组比较,随着药物浓度的增加,BDNF、TrkB及p-CREB蛋白的表达逐渐降低,浓度越高,抑制作用越显著。实验结论:通过检测人参皂苷Rf对BDNF-TrkB-CREB信号途径的影响,进一步阐明了人参皂苷Rf通过调节BDNF-TrkB-CREB信号途径参与调控子宫内膜异位症的疼痛及炎症反应这一作用机制,为子宫内膜异位症的治疗提供了新的实验依据。