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背景和目的低氧(Hypoxia)是生物体在自然活动中可能受到的主要应激之一,它对包括人类在内的生物的发育、行为和健康状况等有着重要影响。它是一种非特异性应激原,它可诱导机体产生应激反应。下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(Hypothalamus-pituitary-adrenal axis, HPA)是机体重要的体液调节系统和应激反应系统,对各种应激做出应答反应,以新的稳态调节,适应变化了的不利环境。下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin releasing factor, CRF)肽是HPA轴的脑中枢调节者,它调节神经和体液两大系统。CRF通过与CRFR1(Corticotropin-releasing factor receptor1)和CRFR2(Corticotropin-releasing factor receptor2)两个主要的受体结合发挥作用。CRFR1属G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor, GPCRs)家族,在中枢神经系统和外周组织广泛分布。CRFR1参与低氧应激生理功能调节,对神经-内分泌-免疫网络系统中重要低氧靶基因和蛋白起核心主导调节作用。β-Arrestin是G蛋白偶联受体(-protein coupled receptor, GPCRs)信号通路的重要负调节因子,与G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptor kinases, GRK)联合作用,可以使GPCRs对激动剂的敏感性下降,发生受体的脱敏反应,调节受体内吞、信号转导及细胞凋亡等。首先,被激动剂激活的GPCRs与GRK结合发生磷酸化,促使β-Arrestin从非活化的晶体结构转变为对受体高亲和结构,与磷酸化的活化GPCRs结合,形成三聚体,阻止了受体与G蛋白之间的继续作用。本实验室利用低气压舱模拟高原低氧,从整体和细胞水平,系统地研究了高原低氧应激与适应及其作用机理。本实验目的是研究急性和连续慢性低氧对大鼠大脑前额叶皮层CRF、CRFR1、CRFR2、GRK3和β-Arrestin1/2基因表达的影响,分析低氧调节CRFR1受体的细胞内信号通路；利用培养大鼠原代星形胶质细胞,研究神经肽CRF对细胞内β-Arrestin1/2、Gas、cAMP、PKC等分子表达的调节。实验设计和方法利用低氧舱模拟高原低氧的方法,将实验大鼠暴露于低氧7km(8.0%02,41.83kPa)8h和24h,5km(10.8%O2,54.02kPa)连续低氧5d和15d,动物在低氧暴露结束后被牺牲,大脑用于本实验研究。采用实时定量PCR研究低氧对大鼠大脑前额叶皮层CRF、CRHR1、CRHR2、GRK3和β-Arrestin1/2基因表达的影响。培养大鼠原代星形胶质细胞,研究神经肽CRF对β-Arrestin1/2、Gas、cAMP、PKC亚型表达的调节。实验结果1.急性7km低氧8h可以增加大鼠大脑前额叶皮层CRF mRNA表达,而7km低氧24hCRF mRNA表达和对照组相比没有显著性差异；急性7km低氧8h可以增加大鼠大脑前额叶皮层CRFR1mRNA表达,而7km低氧24h,CRFR1mRNA表达明显减少；7km低氧8h后大鼠大脑前额叶皮层CRFR2mRNA表达明显减少,而7km低氧24hCRFR2mRNA表达没有显著性差异；而5km连续慢性低氧5d和15d后,CRF、CRFR1和PCRFR2mRNA基因表达回复到对照水平,与对照组比较无明显差异。2.急性7km低氧8h可以增加大鼠大脑前额叶皮层GRK3mRNA表达,而7km低氧24h, GRK3mRNA表达明显减少,5km低氧连续5d明显降低GRK3mRNA表达,而连续15d低氧后,GRK3mRNA表达恢复对照水平。3.7km低氧8h后大鼠大脑前额叶皮层β-Arrestinl mRNA表达明显减少,7km低氧24h后β-Arrestinl mRNA表达没有差异；5km连续低氧5d后,β-Arrestin1mRNA表达没有差异,而在5km连续15d低氧后β-Arrestin1mRNA表达明显升高。7km低氧8h大鼠大脑前额叶皮层β-Arrestin2mRNA表达没有差异,而在7km低氧24h后β-Arrestin2mRNA表达明显减少；慢性5km连续低氧5d和15d对β-Arrestin2mRNA表达没有影响。4.在原代星型胶质细胞,CRF孵育30min可以显著升高细胞Gas、cAMP表达；CRF孵育8h后PKCε亚型蛋白表达有显著上升,但PKCpII蛋白表达无变化；同时发现CRF孵育8h显著降低了β-Arrestin1mRNA表达,而β-Arrestin2mRNA表达没有变化。小结急性低氧7km8h上调GRK3、CRF和CRFR1,下调CRFR2受体基因表达,而7km24h严重低氧抑制GRK3、CRP、CRFR1和CRFR2受体基因表达,同时也抑制β-Arrestin2mRNA;慢性连续低氧通过增加β-Arrestin1mRNA下调CRFR1受体基因表达,是CRFR1受体脱敏的机制之一。机体CRF分泌的减少,以及β-Arrestin1mRNA的增加使CRFR1受体脱敏可能是机体对慢性低氧的反应性降低的基础。在原代星型胶质细胞,CRF短时通过细胞CRFR1受体活化的Gas. cAMP的调节PKA信号通路。而长时调节PKC信号通路主要是通过PKCe亚型,不是PKCβⅡ。CRF孵育8h后β-Arrestin1mRNA表达下调与整体大鼠急性低氧7km的结果一致,提示严重低氧或高水平CRF暴露抑制β-Arrestin1mRNA和CRFR1mRNA。