论文部分内容阅读
本试验使用体外培养的原代猪脾脏淋巴细胞,然后建立GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞模型,再于其中单独或者联合添加DON与亚硒酸钠(Na2SeO3),来探究DON致GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞氧化损伤作用、Na2SeO3对DON致GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞氧化损伤毒性的拮抗作用以及GPX1在其中的作用。方法:(1)GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞的建立:构建pEGFP-GPx1质粒,将其转入细胞,通过qRT-PCR和蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术进行鉴定。(2)抗氧化指标的检测:试验分为12组,分别为D1-D4四个倍比浓度梯度组(DON 0.1025μg/mL-0.820μg/mL),S(Na2SeO3 2μmol/L),SD1-SD4四个倍比浓度梯度组(Na2SeO3 2μmol/L+DON 0.1025μg/mL-0.820μg/mL),P(正常细胞),C(过表达组细胞)和K(空载体组细胞),分别检测各组12、24和48 h时GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞中的抗氧化指标和自由基含量。结果:(1)GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞的建立:本试验采用qRT-PCR技术检测细胞内GPX1基因的表达量,过表达组细胞中的GPX1 mRNA的表达量为对照组的3.876倍。GPX1的WB试验的显影结果显示,过表达组GPx1蛋白的表达量是对照组的1.570倍,呈现显著性差异(P<0.05)。上述结果表明GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞建立成功。(2)抗氧化指标的检测:GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞(C组)中,与正常猪脾脏淋巴细胞(P组)和转入空载体的猪脾脏淋巴细胞(K组)相比,各个指标在各个时间点没有明显的变化(P>0.05)。DON单独作用(D组)于GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞,分别培养12、24、48 h后,D组细胞中,ROS、MDA和H2O2含量呈现出上升趋势。SOD、CAT和GSH-Px活力,GSH含量,细胞T-AOC和抑制羟自由基能力呈现下降趋势。D组之间相互比较起来,各个时间点中,随着DON浓度的增加,ROS、MDA和H2O2含量呈现出上升趋势,SOD、CAT和GSH-Px活力,GSH含量,细胞T-AOC和抑制羟自由基能力呈现出下降的趋势。Na2SeO3单独作用组(S组)中,在12、24、48 h时,与C组相比较,ROS、MDA和H2O2含量均显著下降(P<0.05),SOD、CAT和GSH-Px活力,GSH含量,T-AOC和抑制羟自由基能力均显著提高(P<0.05)。同时添加DON和Na2SeO3(SD组),在12、24、48 h时,与相对应的D组比较,SD组细胞中ROS、MDA和H2O2含量呈现出下降趋势。SOD、CAT和GSH-Px活力,GSH含量,T-AOC和抑制羟自由基能力呈现出上升趋势。结论:(1)GPX1基因过表达,猪脾脏淋巴细胞的抗氧化能力有所提高;(2)DON能够显著地导致猪脾脏淋巴细胞的氧化损伤,并且随着浓度的升高,损伤越严重,呈浓度依赖效应。将GPX1过表达之后,氧化损伤有所减轻,表明了GPX1过表达能够拮抗DON对细胞的毒性;(3)亚硒酸钠作用于GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞,将减轻细胞的氧化损伤,表明亚硒酸钠在GPX1过表达型猪脾脏淋巴细胞中发挥了抗氧化作用;同时,还能够有效地拮抗DON对该细胞的氧化损伤,充分证明亚硒酸钠能够拮抗DON的氧化损伤毒性作用。结合第(2)点来看,GPX1在硒拮抗DON毒性中发挥了重要作用。