产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆、测序及其核心区的原核表达

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:dldx05444011
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【目的】本研究拟以产甲酸草酸杆菌草酰辅酶A脱羧酶oxc基因克隆为实验材料,构建产甲酸草酸杆菌草酰辅酶A脱羧酶oxc基因核心区重组表达质粒pET-OXC-1(202~351aa)、及其原核表达重组菌,以获得有活性的oxc基因核心区重组蛋白,进而为建立检测机体内分解草酸的草酰辅酶A脱羧酶及其含量的方法提供实验材料,并为预测机体罹患肾结石的风险和及早进行预防研究奠定基础。【方法】本实验以产甲酸草酸杆菌标准菌株(ATCC 35274)基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得草酰辅酶A脱羧酶基因oxc(1704bp)并构建重组质粒pGEM-T-oxc。应用DNA重组技术,构建草酰辅酶A脱羧酶oxc基因核心区的原核表达载体pET-OXC-1(202~351aa),转化BL21(DE3)并筛选重组菌E.coli His-OXC-1。在优化条件下诱导重组菌表达,收集菌体经超声波破碎和裂解后提取不溶性包涵体,以8mol/L尿素处理包涵体提取物并进行Ni-NTA亲和层析纯化,纯化表达产物经透析复性后以SDS-PAGE分析其复性效果。【结果】本研究成功获得重组菌E.coli His-OXC-1,经诱导表达后可产生分子质量约为19.8ku的目的融合蛋白,其以包涵体形式存在于菌体内;在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导表达6 h的优化条件下,重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%~45%的目的蛋白;裂菌后获得分子质量约为19.8 ku的目的包涵体蛋白;经Ni-NTA亲和层析纯化后,可除去分子质量约为31~40 ku间的杂蛋白,获得分子质量约为19.8 ku的高纯度目的蛋白;复性产物保持较高的纯度,SDS-PAGE仅显现分子质量约为19.8 ku的目的蛋白条带。【结论】从产甲酸草酸杆菌(ATCC 35274),克隆出编码草酰辅酶A脱羧酶的oxc基因,成功构建了草酰辅酶A脱羧酶oxc基因核心区重组表达质粒pET-OXC-1(202~351aa)并获得其原核表达重组菌E.coli His-OXC-1,获得了有活性的oxc基因核心区重组蛋白。
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