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目的:(1)实验研究:在细胞水平探讨橙皮素(Hesperetin)对血小板源性生长因子-BB(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)诱导的大鼠原代胸主动脉血管平滑肌细胞(rat vascular smooth muscle cells,RVSMCs)增殖活性、迁移能力以及表型转化的作用。在动物水平探讨Hesperetin对仓鼠颈动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)斑块形成的作用。(2)临床研究:用富含Hesperetin的橙汁对As高危风险人群进行小样本护理饮食干预预试验,将Hesperetin在As中的作用进行临床验证。方法:(1)实验研究:体外实验研究中首先改良组织块贴壁法分离、培养原代RVSMCs;观察记录原代RVSMCs形态、数量及生长状态;用细胞免疫荧光化学法检测平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌SM22α蛋白(smooth muscle 22α,SM22α)以及调宁蛋白(Calponin)的表达,鉴定原代RVSMCs的表型和纯度;用CCK-8试剂盒检测第三代RVSMCs的增殖活性;用不同浓度的Hesperetin(10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L)处理RVSMCs 24h,实验结束后用CCK-8试剂盒检测Hesperetin对RVSMCs活力的影响,观察Hesperetin对RVSMCs的细胞毒性作用;用不同浓度(2ng/m L、5ng/m L、10ng/m L、25ng/m L、50ng/m L)的PDGFBB处理RVSMCs 24h,0ng/m L作为空白对照组,用CCK-8试剂盒检测RVSMCs增殖活性;用不同浓度(25ng/m L、50ng/m L、100ng/m L)的PDGF-BB处理RVSMCs24h,用Western Blot检测α-SMA和SM22α的蛋白表达量,筛选出PDGF-BB建立RVSMCs增殖模型最适合的药物浓度;采用CCK-8试剂盒检测不同浓度(10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、300μmol/L)的Hesperetin对PDGF-BB刺激RVSMCs增殖活性的影响,筛选出最适宜后续实验的Hesperetin药物干预浓度;用筛选出最佳药物浓度的PDGF-BB和Hesperetin将RVSMCs分为对照组、模型组(PDGF-BB组)、治疗组(PDGFBB+Hesperetin)干预RVSMCs,用细胞划痕实验检测各组RVSMCs迁移能力,用Western Blot检测各组收缩表型标志因子α-SMA、SM22α以及合成表型标志因子ELN、细胞增殖因子PCNA蛋白表达水平的变化。在体内实验研究中用高脂饮食联合颈动脉结扎的方法建立拟人化仓鼠颈动脉As模型,同时用不同浓度的Hesperetin进行灌胃,将30只实验动物随机分为对照组(NC组)、模型组(Model组)、低剂量组(L-Hesperetin组)、中剂量组(M-Hesperetin组)、高剂量组(HHesperetin组),实验7周后取各组仓鼠颈动脉组织进行冰冻切片和油红O染色,观察各组仓鼠颈动脉As病变情况。(2)临床研究:用动脉硬化检测仪对2018年2月-2018年9月在贵州医科大学附属医院体检中心体检的人群进行As风险筛查,在As高危风险人群中随机抽取16个样本,随机分成对照组和治疗组,对照组人群进行常规健康教育,治疗组人群除常规健康教育外每天喝500m L富含Hesperetin的橙汁进行饮食护理干预,8周后对两组人群进行As风险筛查,观察富含Hesperetin的橙汁对As风险指标臂踝脉搏波传导速度(brachialal ankle pulse wave velocity,Ba PWV)的影响,对Hesperetin在As中的作用进行临床验证。结果:(1)实验研究:体外实验研究中成功分离并培养出SD大鼠原代RVSMCs,细胞呈长梭形或三角形贴壁生长,传代后的RVSMCs排列紧密,出现“峰-谷”状特征;细胞免疫荧光结果显示,培养出的细胞纯度大于95%;CCK-8检测结果显示传代后3-5天RVSMCs增殖能力最强,是做后续实验的最佳时期;各种浓度的Hesperetin均不会对RVSMCs产生细胞毒性;浓度为25ng/m L的PDGF-BB是体外建立RVSMCs增殖模型最适宜的干预浓度;浓度为100μmol/L的Hesperetin是治疗组的最佳干预浓度;划痕实验结果表明,25ng/m L PDGF-BB能够显著增加RVSMCs的迁移能力,加入100μmol/L Hesperetin后PDGF-BB诱导的RVSMCs迁移能力下降;Western Blot结果表明,25ng/m L PDGF-BB能够显著降低RVSMCs收缩表型标志因子α-SMA、SM22α的蛋白表达,增加合成表型标志因子ELN、PCNA的蛋白表达,而加入100μmol/L Hesperetin后,RVSMCs收缩表型标志因子α-SMA、SM22α蛋白表达量上升,合成表型标志因子ELN、PCNA蛋白表达水平下降。在动物体内实验研究中成功建立拟人化仓鼠颈动脉As模型并进行Hesperetin干预,与NC组比较,Model组仓鼠体重增加量升高,颈动脉油红O染色结果显示,Model组颈动脉内膜中膜增厚,管腔面积变小,有大量的As脂质斑块形成,表明颈动脉As造模成功;与Model组比较,不同浓度Hesperetin干预组均可降低仓鼠体重增加量,油红O染色结果显示,不同浓度Hesperetin治疗组均可见到颈动脉内膜中膜厚度减少,管腔狭窄程度减轻,脂质沉积减少,As斑块病变程度减轻。(2)临床研究:将富含Hesperetin的橙汁对As高危风险人群进行饮食护理干预,发现橙汁能有效降低As风险指标Ba PWV的值。结论:(1)实验研究:体外实验研究发现Hesperetin能够抑制PDGF-BB诱导的RVSMCs增殖能力和迁移能力,进而影响RVSMCs表型转化。体内实验研究发现Hesperetin可以抑制拟人化仓鼠颈动脉As斑块形成。(2)临床研究:富含Hesperetin的橙汁能够有效降低As风险指标Ba PWV,从而降低As的发病风险。