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第一部分:多奈哌齐对骨癌痛大鼠吗啡耐受的影响及其内在机制的初探研究目的:吗啡耐受是临床癌痛治疗中急需解决的难点,有关吗啡耐受的机制及如何减轻吗啡耐受也一直以来是研究的热点问题。乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）抑制剂多奈哌齐作为治疗阿尔兹海默病的一线药物,近年来被发现具有减轻大鼠吗啡耐受的作用,但目前机制尚不明确。我们通过建立大鼠胫骨癌痛（bone cancer pain,BCP）模型,观察不同剂量多奈哌齐对BCP大鼠吗啡耐受的影响,以及中枢神经系统 N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）-NR1/PKC信号通路、星形胶质细胞标记物GFAP在多奈哌齐减轻BCP大鼠吗啡耐受中的作用。研究方法:选择鼠龄6-7周,体重200±20g的清洁级健康雌性Wistar大鼠,在骨髓腔内注射Walker 256肿瘤细胞建立BCP模型。将建模成功的BCP大鼠随机分为:生理盐水（NS）组,吗啡10 mg/kg皮下注射（Mor）组,中剂量多奈哌齐1.5 mg/kg灌胃（Dpz-M）组,吗啡+低剂量多奈哌齐1.0 mg/kg（Mor+Dpz-L）组,吗啡+中剂量多奈∶哌齐1.5 mg/kg（Mor+Dpz-M）组,吗啡+高剂量多奈哌齐2.0 mg/kg（Mor+Dpz-H）组。连续给药14天,每天给药后30min行行为学测试,观察大鼠疼痛行为学变化。14天后处死大鼠,采用Western blot、免疫荧光法检测各组脑皮质和脊髓背角NMDAR-NR1、PKC、GFAP的表达情况。另取建模成功的BCP大鼠,应用鞘内注射NR1基因小干扰RNA（siRNA）和非选择性NMDAR拮抗剂MK-801的方法将BCP大鼠随机分为:生理盐水（Sal+Sal）组,多奈哌齐（Dpz+Sal）组,吗啡（Mor+Sal）组,吗啡+多奈哌齐（Mor+Dpz）组,siRNA（siRNA+Sal）组,吗啡+siRNA（Mor+siRNA）组,吗啡+多奈哌齐+siRNA（Mor+Dpz+siRNA）组,MK-801（MK-801+Sal）组,吗啡+MK-801（Mor+MK-801）组,吗啡+多奈哌齐+MK-801（Mor+Dpz+MK-801）组。连续给药7天,每天给药后30min行行为学测试,观察大鼠疼痛行为学变化。研究结果:骨癌痛模型建模成功。14天的von-Frey和热板行为学结果均显示,从给药第9天开始,Mor组与NS组痛觉敏感阈值无显著差异,即吗啡耐受出现。热板实验中,第9天时,Mor+Dpz-H组的%MPE仍显著高于Mor组（P＜0.05）,第11天时,Mor+Dpz-H组与Mor组的%MPE无显著差异。Western blot和免疫荧光结果显示,与NS组相比,Mor组脑皮质NR1的表达显著增加（P＜0.05）;与Mor组相比,Mor+Dpz-L组、Mor+Dpz-M组和Mor+Dpz-H组脑皮质NR1的表达显著减少（P＜0.05）。与NS组相比,Mor组脊髓背角NR1的表达未见显著差异Dpz-M组和Mor+Dpz-H组脊髓背角NR1的表达显著增加（P＜0.05）。PCR和Western blot结果显示,与对照组相比,NR1 siRNA组和MK-801组脑皮质和脊髓背角NR1的表达均显著减少。7天的甩尾行为学结果显示,与Mor+Sal组相比,Mor+siRNA组在给药第3、4、5、6、7天的甩尾潜伏期均显著延长（P＜0.05）,Mor+MK-801组在给药第1、4、5天的甩尾潜伏期均显著延长（P＜0.05）。与 Mor+Dpz 组相比,Mor+Dpz+siRNA 组在给药第 1、5、6天的甩尾潜伏期均显著延长（P＜0.05）,Mor+Dpz+MK-801组在给药第3、4、5天的甩尾潜伏期均显著延长（P＜0.05）。脑皮质和脊髓背角PKC的表达均未发生显著变化。与NS组相比,Mor组、Dpz-M组、Mor+Dpz-M组脑皮质的GFAP表达量均显著增加（P＜0.05）;Mor组脊髓背角GFAP的表达量无显著变化,Dpz-M组,Mor+Dpz-M组可显著上调脊髓背角GFAP的表达（P＜0.05）。研究结论:多奈哌齐呈剂量依赖性的减轻BCP大鼠的吗啡耐受,并提高吗啡的镇痛作用。在脑皮质水平,多奈哌齐通过抑制吗啡诱导的NR1和GFAP的激活减轻吗啡耐受。吗啡不影响脊髓背角NR1、GFAP的表达,而多奈哌齐对脊髓背角NR1、GFAP均有显著激活作用。第二部分:多奈哌齐对非疼痛大鼠吗啡耐受及脊髓背角NMDAR/PKC γ/CaMKⅡα信号通路表达的影响研究目的:重点探究脊髓背角NMDAR-NR1、NR2A、NR2B及下游PKCγ、CaMKⅡα信号分子在多奈哌齐减轻非疼痛大鼠吗啡耐受中的作用。研究方法:选择鼠龄7-8周,体重200-230g的清洁级健康雌性Wistar大鼠:生理盐水（NS）组,吗啡10 mg/kg（Mor）组,吗啡+中剂量多奈哌齐1.5 mg/kg（Mor+Dpz-M）组,吗啡+高剂量多奈哌齐2.0 mg/kg（Mor+Dpz-H）组,中剂量多奈哌齐1.5 mg/kg（Dpz-M）组,高剂量多奈哌齐2.0 mg/kg（Dpz-H）组。连续给药14天,观察行为学变化。14天后处死大鼠,采用Western blot、免疫组化法检测各组脊髓背角NMDAR-NR1、NR2A、NR2B、PKC γ、CaMKⅡα 的表达情况。研究结果von-Frey实验中,从第6天开始,Mor组与NS组的机械性痛敏感阈值无显著差异,吗啡耐受出现;与Mor组相比,在给药第4天,Mor+Dpz-M组和Mor+Dpz-H组的机械性痛阈PWT均显著提高。热板实验中,从第8天开始,Mor组与NS组的%MPE无显著差异,吗啡耐受出现;在给药第2天,Mor+Dpz-M组的%MPE显著高于Mor组（P＜0.05）;在给药第 4、6、8、10 天,Mor+Dpz-H组的%MPE 均显著高于 Mor 组（P＜0.05）;在第4、6、10天,Mor+Dpz-H组的%MPE均显著高于Mor+Dpz-M组（P＜0.05）。甩尾实验中,从第10天开始,Mor组与NS组的%MPE无显著差异,吗啡耐受出现在给药第4、6、14天,Mor+Dpz-M组的%MPE均显著高于 Mor 组（P＜0.05）;在给药第 4、6、8、10、14 天,Mor+Dpz-H 组的%MPE均显著高于Mor组（P＜0.05）;在给药第2、6、8、10天,Mor+Dpz-H组的%MPE均显著高于Mor+Dpz-M组（P＜0.05）。Western blot和免疫组化结果显示,与NS组相比,Mor组脊髓背角NR1、NR2A、NR2B的表达无显著差异;而Dpz-H组NR1的表达显著增强（P＜0.001）,Dpz-M组NR2A和NR2B的表达显著增强（P＜0.001）,Mor+Dpz-H组NR2B的表达显著增强（P＜0.001）。与NS组相比,Mor组PKCγ和CaMKⅡα的表达显著增强（P＜0.001）;与Mor 组相比,Mor+Dpz-M组和Mor+Dpz-H组PKCγ和CaMKⅡα的表达显著下降（P＜0.001）。PKCγ主要表达在脊髓背角Ⅱ层和整个脊髓灰质区,CaMKⅡα主要表达在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ层。研究结论:在脊髓水平,多奈哌齐可通过抑制吗啡诱导的脊髓背角浅层神经元内PKC γ和CaMKⅡα的激活而减轻吗啡耐受。吗啡不影响脊髓背角NMDAR的表达,而多奈哌齐对脊髓背角NMDAR-NR1、NR2A、NR2B均有显著激活作用。