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基于小分子配体的保守性,我们实验室提出了原始蛋白结构起源的小分子诱导模型,认为最早产生的蛋白质是由ATP诱导选择产生的。采用c DNA展示技术,对该假说进行了初步验证,获得的丰度最高的蛋白质具有ATP结合能力及ATP水解活性。本课题在该研究基础上,对筛选得到的丰度最高蛋白质进行了初步的功能研究,主要内容包括对体外进化ATP结合蛋白的生化性质测定及互作蛋白的筛选研究。首先,设计新引物,以Nco I和Eco R I作为酶切位点,构建原核表达载体p ET-28b-abp1,自诱导表达获得高浓度全长蛋白。BAC试剂盒进行定量检测蛋白浓度为2.11 mg/m L。核磁共振法解析蛋白质二级结构,发现蛋白质主要以α-Helix和无规卷曲的二级结构形式存在。测定蛋白质与ATP结合常数Kd值为0.303?0.073μM。其次,钼酸盐-孔雀石绿分光光度法对蛋白进行了酶活性质的测定,发现该蛋白同时具有ATPase、UTPase、GTPase、CTPase四种酶活性,其中ATPase活性最强。使用HPLC法研究蛋白质水解ATP生成的产物,发现蛋白质水解ATP生成的主要产物是ADP。在20-100 m M浓度范围内随着蛋白酶浓度增加,酶活增大。在最适酶活条件的测定中发现,酶促反应的最适温度为45℃,该温度高于普通酶的最适温度,由于原始环境温度偏高,也恰好能够说明我们的蛋白具有早起源蛋白的特性;酶促反应最适p H值为8.0;40 m M蛋白酶的体系中最适底物浓度为12.5μM;并发现随着盐离子浓度增加,蛋白质酶活降低。最后,构建原核表达载体p ET-28b-abp2,加入Avi-tag序列,制备了生物素化的诱饵蛋白。采用c DNA展示技术在由15种早起源氨基酸组成的随机肽库中进行六轮互作蛋白的筛选,高通量测序结果发现丰度最高序列是诱饵蛋白序列本身,表明该蛋白易于形成寡聚体。蛋白交联实验和分子筛实验证明该蛋白以二聚体形式存在。本研究所得结果不仅有助于我们了解早起源蛋白质理化性质,而且对蛋白质相互作用起源机制乃至生命的起源机制也有较大的意义。