水稻(Oryza sativa)是中国主要的粮食作物,对保障我国粮食安全至关重要。水稻在整个生长发育过程中都会受到各种生物和非生物胁迫,通过育种手段增强水稻对胁迫的抵抗力十分重要。稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是水稻三大病害之一,每年有10%-30%的水稻收成由于感染稻瘟病而损失,严重威胁粮食安全。土壤盐渍化是限制土地利用率和导致作物产量下降的主要非生物胁迫之一,在全球广泛存在,目前全球有大约20%的土地盐碱化,且其盐渍化面积逐年增加。ALS1编码一个富含半胱氨酸的类受体激酶(Cysteine rich repeat RLKs,CRKs),属于类受体激酶(Receptor-like kinases,RLKs)家族,多数CRKs受活性氧的差异调控,在应激反应、调节抗病反应和细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)中发挥重要作用。通过蛋白序列与进化树分析、基因表达模式分析、亚细胞定位分析、ALS1干涉植株表型分析、稻瘟病抗性分析、盐胁迫抗性分析对ALS1基因进行功能解析。研究结果如下:1 ALS1的蛋白结构与定位突变体als1是一个类病斑显性突变体,4叶期时,突变体als1开始在叶片和叶鞘出现褐色的斑点,一直持续到成熟期。叶龄和鞘龄越大,沉积的病斑越多。ALS1编码一个富含半胱氨酸的类受体激酶CRK,包含一个氨基末端信号肽,两个保守的CRR结构域和一个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。系统发生树分析表明,ALS1属于高度保守的CRKs蛋白家族。亚细胞定位结果提示ALS1定位于细胞膜,而ALS1的突变并没有改变其定位。2 ALS1基因的表达模式分析取苗期、分蘖期、抽穗期的水稻叶片进行qRT-PCR分析,结果显示ALS1主要在叶片、叶鞘表达,其他部位表达量较低。对ProALS1:GUS的转基因植株的各个组织进行GUS蛋白的染色实验,结果显示ALS1主要在叶片、叶鞘的维管束的筛管中表达。3 ALS1正调控水稻对稻瘟病的抗性反应对苗期的野生型、突变体和ALS1-RNAi植株接种稻瘟病生理小种,结果显示与野生型相比,突变体als1的病斑面积较小,表现出更强的抗病性,ALS1-RNAi植株的病斑面积较大、病情更为严重。野生型、突变体als1和ALS1-RNAi植株从各自发病的叶片上分离出来的孢子数目,最多的是ALS1-RNAi植株,最少的是突变体als1。与野生型相比,稻瘟病管家基因MoPot2在突变体中表达量极显著下调,在ALS1-RNAi中极显著上调。与野生型相比,突变体als1对稻瘟病抗性增强,ALS1-RNAi对稻瘟病抗性降低,说明ALS1可能正调控水稻对稻瘟病的抗性。4 ALS1负调控对盐胁迫的抗性将一周龄左右的野生型、突变体als1和ALS1-RNAi植株用200 m M的NaCl、200 mM KCl和20 Mm LiCl溶液处理7天。结果显示,经NaCl、KCl处理后的植株,与对照相比,野生型植株少量死亡、叶片卷曲,突变体als1大量死亡、叶片大量卷曲,ALS1-RNAi植株没有发生死亡、叶片少量卷曲。与野生型相比,经NaCl和KCl处理后的突变体als1出现更严重的死亡现象,ALS1-RNAi植株叶片卷曲、少量死亡现象。经LiCl处理后的野生型、突变体als1和ALS1-RNAi植株对LiCl不敏感。结果表明,ALS1负调控了水稻对NaCl和KCl的抗性。对胁迫处理后野生型、突变体als1和ALS1-RNAi植株的生长发育情况进行统计,结果显示,NaCl、KCl对株高都有显著的抑制作用,而LiCl没有明显变化。推测als1对Na~+、K~+敏感。对盐胁迫处理后的野生型、突变体als1和ALS1-RNAi的ROS酶系统、部分抗性基因进行定量分析。结果表明,与野生型相比,活性氧清除酶类的表达量在突变体als1中极显著下调,在ALS1-RNAi中的表达量极显著上调;突变体als1中活性氧生成酶类的表达量极显著上调,在ALS1-RNAi中的表达量极显著下调,推测突变体als1中活性氧积累较多,而在ALS1-RNAi中积累较少。与野生型相比,对盐胁迫抗性起正调控作用的部分基因在突变体als1中的表达量明显下调,在ALS1-RNAi植株中的表达量明显上调,推测突变体als1在应对盐胁迫时的部分抗性基因的表达受到抑制,而在ALS1-RNAi中被激活。