论文部分内容阅读
目的:本课题从黄连中分离提取并纯化生物碱,筛选出抑制角质形成细胞凋亡的活性成分以缓解皮肤屏障破损从而达到治疗特应性皮炎的作用,研究其作用机制并对治疗该疾病的黄连提取物进行初步质量标准研究,为后期黄连相关产品研发提供理论依据。方法和结果:1、首先利用醇提法、萃取、硅胶色谱柱、大孔树脂及高效液相色谱法等分离纯化方法,从黄连中分离提取生物碱并进行结构确证,结果得到7种已知生物碱分别是药根碱,表小檗碱,黄连碱,木兰花碱,巴马汀,非洲防己碱以及小檗碱。2、下一步在体外进行活性成分筛选以寻找抑制角质形成细胞(Ha Ca T)凋亡的活性成分。通过MTT筛选出适宜的药物浓度,结果显示木兰花碱(MAG)具有较低的细胞毒性。利用干扰素-γ(IFN-γ)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对Ha Ca T细胞进行诱导使其凋亡从而模拟特应性皮炎患者(AD)角质层细胞凋亡的现象。利用流式细胞仪检测技术以及Hoechst 33342染色技术进行活性成分的筛选及验证,最后在上述7个生物碱中找到了MAG以剂量依赖形式(500、1000、1500μg/m L)抑制了Ha Ca T细胞凋亡。3、为了进一步研究MAG以及黄连提取物对AD的作用效果,选择BALB/c雌鼠进行体内实验验证。实验过程设计了对照组(NC)、模型组(AD)、阳性药物组(WDO)、木兰花碱组(MAG)以及黄连提取物组(RCE),利用0.5%和2%的2,4-二硝基氯苯试剂对小鼠背部皮肤进行造模。选择了皮损严重程度评估、行为指标评估、H&E组织染色、免疫组化检查、血清中IL-4和Ig E含量以及脏器指数等项目对小鼠进行实验考察。结果显示,经过了一段时间治疗后,WDO组、MAG组和RCE组在皮肤破损、瘙痒以及血清中IL-4和Ig E含量等指标上较于AD组呈下降趋势;其中MAG组的H&E组织染色结果显示角质层厚度减小、炎症细胞浸润减少、毛囊恢复等;Caspase-3免疫组化的结果显示AD组(1054.9±74.9)阳性结果染色最多,MAG组最少(509.8±60.0,p<0.01VS AD)4、由上述实验结果得知MAG在体内体外均具有抑制角质形成细胞凋亡的作用,接下来对其作用机制进行研究。首先利用HT-docking、CTD及KEGG等生物信息学技术手段找到MAG在治疗AD的过程中与凋亡相关的作用靶点,为机制研究提供可能性的参考。其次,利用流式细胞术对线粒体膜电位进行检测,结果显示MAG可以降低线粒体低膜电位;通过蛋白免疫印迹法对Caspase-3\7\8\9、Bid、Cytochrome C以及Cathepsin B(CTSB)的表达进行检测,结果显示MAG抑制了Cytochrome C从线粒体内膜上的释放,其余蛋白表达量均下调,表明了MAG的作用机制可能与线粒体有关。5、最后,动物实验证明RCE对AD治疗起到缓解作用,参考2015版《中国药典》质量标准研究方法,对三批黄连提取物进行初步质量标准研究,为后续黄连产品开发提供理论依据。从系统适应性及方法学验证进行考察,以木兰花碱、巴马汀以及小檗碱为特征峰,结果显示精密度、重复性以及稳定性等均符合要求,木兰花碱的总平均含量为3.216%,巴马汀总平均含量为14.090%,小檗碱总平均含量为5.893%。结论:综上所述,本课题通过体内体外实验证明了从黄连中分离得到的MAG可抑制Ha Ca T细胞的凋亡,初步机制可能是在MAG作用下使Bid在溶酶体失稳被组织蛋白酶CTSB裂解后转移到线粒体,抑制了Cytochrome C从线粒体内膜的释放,降低了Caspase-3\7\8\9、Bid、CTSB蛋白的表达,从而起到了缓解AD皮损的作用。另外,对治疗AD的黄连提取物进行初步质量标准研究,为后期黄连相关产品研发奠定理论基础。