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发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是近年来在我国首次发现的一种新型病毒,属于布尼亚病毒科白蛉病毒属成员。它可以引起人患发热伴血小板减少综合征,主要以发热、血小板减少,白细胞减少及胃肠疾病,严重者因多器官功能衰竭而死,致死率高达10~30%。对于该病目前没有有效的治疗方法,对人们的生命健康造成巨大的威胁。因此,探索SFTSV的致病机理及宿主抗病毒机制将为开发有效的预防与治疗方法奠定理论基础。宿主天然免疫反应是抵御多种病毒感染的第一道防线,此反应主要由I型干扰素诱导和NK细胞的活化而启动。Toll样受体(TLRs)和RIG-I受体在干扰素抗病毒过程中发挥重要的作用。I型干扰素诱导之后,酪氨酸激酶信号在转换器和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路通过加强STAT1的磷酸化水平和干扰素刺激基因反应元件(ISRE)活性而激活,导致产生几百种干扰素刺激基因(ISGs),从而细胞表现出抗病毒作用,限制病毒的复制和蔓延。干扰素诱导跨膜蛋白是I型干扰素刺激产生一种小分子跨膜蛋白,是一种能够阻断病毒进入细胞的宿主限制因子。干扰素诱导跨膜蛋白主要包括IFITM1、IFITM2和IFITM3,均具有广谱的抗病毒作用。目前,已研究证明IFITMs对裂谷热病毒等几种布尼亚病毒表现明显的抑制作用,而对SFTSV感染的影响未有相关报道。研究目的:初步探索SFTSV感染对宿主细胞内固有抗病毒信号转导通路及抗病毒限制因子IFITMs等的调控作用。目前,IFITM3对SFTSV抑制作用没有相的关报道,因此本研究通过分析SFTSV感染对包括IFITM蛋白在内的抗病毒通路关键分子的表达调控作用及IFITM3对SFTSV感染的影响,探讨IFITM3与SFTSV间的关系及其抗病毒作用机制。SFTSV仍无有效的药物或疫苗,完成本次研究为开发特异药物分子或治疗方法提供新的思路和角度。研究内容:1.SFTSV对固有免疫关键分子的调控2.诱导表达IFITM3稳定HEK293细胞系的建立3.IFITM3抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染研究方法:1.SFTSV对固有免疫关键分子的调控根据天然免疫信号通路上的关键分子,我们选择TLR3~8、RIG-I、MDA5、My D88、TBK-1、IRF7、IFN-β、STAT1~6、IFITM1、IFITM2、IFITM3、PKR、Mx1、OAS1、ISG15及ISG56相关分子26个,通过荧光定量PCR检测感染SFTSV不同时间点的固有免疫关键分子表达变化,评价SFTSV对天然免疫信号通路的影响。SFTSV感染HEK293和A549细胞24h后,经IFN-α处理12h后,检测JAK/STATs途径相关分子STAT1、STAT2、IRF9、IFITM1、IFITM2和IFITM3基因表达情况。2.诱导表达IFITM3稳定HEK293细胞系的建立利用Tet-On 3G诱导型真核表达系统,将以构建好的p TRE3G-IFITM3和p LVX-Tet3G共转染于293细胞,在G418和puro加压筛选获得稳定表达IFITM3的诱导型293细胞系,并经Western-blot、MTS和流式细胞术分析鉴定。3.IFITM3抑制发热伴血小板减少综合征病毒感染本实验用SFTSV感染293-Tet3G-IFITM3和已构建好的MDCK-Tet3G-IFITM3后,通过间接免疫荧光,荧光定量PCR和流式细胞术分析评价IFITM3对SFTSV感染或进入的抑制作用。研究结果:1.通过荧光定量PCR检测在SFTSV感染THP-1细胞情况下Toll样受体(TLRs)及其下游分子TBK-1、My D88、STAT1~6、IFITM1、IFITM2、IFITM3、PKR、Mx1、OAS1、ISG15及ISG56等天然免疫信号通路的关键分子表达变化,结果表明,SFTSV感染THP-1细胞后不同时间点,在Toll样受体TLR3~TLR8中,主要以TLR7和TLR8基因表达上调,在RIG-I受体中,RIG-I和MDA5基因表达极大的上调,且其下游的My D88表达稍微增强,IRF7和IFN-β显著增强;在JAK/STAT途径中,STAT1和STAT2表达显著升高,而且其下游的干扰素刺激基因IFITM1、IFITM3、PKR等明显上调。以上结果提示,SFTSV感染THP-1细胞后,宿主细胞启动抗病毒天然免疫反应。IFN-α处理SFTSV感染的HEK293和A549细胞,STAT1、STAT2、IRF9、IFITM1、IFITM2和IFITM3基因表达水平均低于IFN-α处理的正常细胞,暗示SFTSV能够抑制外源性IFN-α诱导的信号通路。2.利用Tet On3G诱导型表达系统,将携带IFITM3的反应载体和调控载体共转染于HEK293细胞内,在嘌呤霉素和G418加压下获得稳定表达IFITM3的诱导型HEK293细胞系,即293-Tet3G-IFITM3,并经Western-blot、MTS和流式细胞术分析鉴定正确。结果表明293-Tet3G-IFITM3稳定表达细胞系构建成功,Dox对诱导表达的IFITM3细胞活力没有明显影响,表达IFITM3的细胞接近100%。3.通过SFTSV感染实验,IFA结果表明Dox诱导表达IFITM3的HEK293和MDCK细胞能够抵抗SFTSV感染。RT-q PCR结果表明:Dox诱导表达的IFITM3能够抑制SFTSV的早期(12h)感染。FCM检测结果表明:Dox诱导表达IFITM3可以抑制SFTSV感染;低p H能够增强SFTSV感染,但不影响IFITM3对SFTSV抗病毒作用。