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血管内皮细胞是构成血管壁的主要细胞成分,不仅参与创伤、休克、感染、心血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展,而且在血管通透性屏障、免疫防御及炎症反应中起着极为重要的作用。生理条件下,血管内皮细胞通过释放内皮衍生松弛因子(EDRF)、血栓调节蛋白(TM)和组织型纤溶酶原激活物(t-PA)等各种活性物质,抑制血小板聚集、血液凝固以及促进纤溶,防止血栓形成,从而维持血流通畅;在IL-1β、LPS、TNF-α等炎性因子的刺激下,血管内皮细胞则可受损,内皮细胞释放的促栓物质和抑栓物质失衡,抗血栓能力减弱,促进血栓形成。人KLF4基因定位于9q31,其蛋白质由470个氨基酸构成。KLF4在体内分布广泛,参与细胞凋亡、增殖、分化以及肿瘤的发生、发展,其调节机制可能与乙酰化修饰有关。1998年,Yet等证实KLF4在人主动脉和脐静脉的内皮细胞中表达,影响内皮细胞炎性调节因子的释放,具有抗炎作用。因此,明确KLF4在炎性因子刺激内皮细胞中的作用,探索KLF4在内皮细胞血栓调节中的作用和可能机制,对阐明炎性因子诱导血栓形成的机制提供实验依据。目的本课题拟通过体外培养人原代脐静脉内皮细胞, IL-1β和TNF-α为炎性刺激因子,观察KLF4、vWF、PAI-1在内皮细胞中的表达变化。采用同源重组方法构建携带反义KLF4基因腺病毒,观察干扰内皮细胞中KLF4表达后,对炎性因子诱导的内皮细胞中vWF、PAI-1的影响,明确KLF4对血栓形成关键物质vWF、PAI-1基因表达的调节,阐明KLF4在内皮细胞血栓调节中的作用,并初步探讨KLF4影响内皮细胞抗栓作用的具体作用机制。方法采用胰蛋白酶消化法,从新鲜脐静脉分离和培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),通过形态学和流式细胞仪方法进行鉴定。炎性刺激因子IL-1β(2.5 ng/mL )、TNF-α(10 ng/mL)分别刺激HUVECs 2h、4h后,以正常HUVECs为对照,提取细胞RNA和蛋白。采用Real-time PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜技术观察脐静脉内皮细胞中KLF4、PAI-1和vWFmRNA、蛋白的表达。通过同源重组方法构建Ad-反义KLF4腺病毒。将KLF4基因片段反向克隆到重组腺病毒载体Ad-Easy系统中的穿梭质粒pshuttle-CMV的多克隆位点(multiple cloning site, MCS ),构建出携带反义KLF4基因片段的重组穿梭质粒pshuttle-CMV-反义KLF4;再将pshuttle-CMV-反义KLF4与重组腺病毒载体Ad-Easy系统中的骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组。酶切线性化重组载体并转染293细胞,经293细胞包装生成携带反义KLF4基因片段的重组腺病毒Ad-反义KLF4。将重组腺病毒Ad-反义KLF4按照不同浓度感染人原代脐静脉内皮细胞,确定最佳感染率。采用Real-time PCR、Westernblot方法观察重组腺病毒Ad-反义KLF4对内皮细胞中KLF4表达的抑制效果。重组腺病毒Ad-反义KLF4感染内皮细胞48h后,IL-1β刺激4h,提收取细胞RNA和蛋白。同时,采用Ad-GFP病毒作为对照。Real-time PCR检测内皮细胞中KLF4、PAI-1、vWF mRNA表达;Western blot检测KLF4、PAI-1蛋白的表达;激光共聚焦显微镜观察KLF4、vWF表达和定位。免疫共沉淀技术观察KLF4乙酰化水平变化。观察抑制KLF4表达对炎性因子刺激内皮细胞中PAI-1和vWF表达的影响,以及可能的作用机制。各组实验数据以均数±标准差( x±s)表示。两组数据间的差异用方差分析。P<0.05为差异有显著性。结果1.选用新鲜脐带作为血管内皮细胞的来源,采用0.25%胰蛋白酶消化法分离原代脐静脉内皮细胞(HUVECs),通过形态学和细胞表面特异性标记的方法进行鉴定,倒置相差显微镜下观察细胞呈梭状或鹅卵石样镶嵌排列,单层生长,胞浆丰富,胞核可见,为圆形或椭圆形;流式细胞仪观察到大部分细胞均可表达vWF抗原和CD31抗原,证实所分离和培养的细胞为HUVEC。2. KLF4在正常脐静脉内皮细胞中表达,定位于细胞核中。炎性因子增强内皮细胞中KLF4的表达。随着刺激时间的延长,KLF4表达逐渐增强。明显高于正常HUVECs中KLF4表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。3. IL-1β、TNF-α刺激内皮细胞中vWF、PAI-1表达,与正常HUVECs中vWF、PAI-1表达比较,差异具有显著性(P<0.05)。炎性因子刺激4h组中vWF、PAI-1表达高于其在2h组中表达(P<0.05)。其中以IL-1β刺激组中vWF、PAI-1表达增加明显,均高于TNF-α刺激组,但差异无统计学意义(P>0.05)。4.成功地构建出携带反义KLF4基因片段的重组腺病毒Ad-反义KLF4,经菌液PCR、酶切和DNA测序鉴定重组腺病毒完全正确,并在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒,获得高浓度Ad-反义KLF4腺病毒。5.荧光显微镜下观察,以MOI值200的Ad-GFP感染HUVECs 48h后,近90%内皮细胞表达绿色荧光。故选择MOI值200的Ad-反义KLF4腺病毒感染HUVECs细胞,观察KLF4对内皮细胞中vWF、PAI-1的调节。6. MOI值200的重组腺病毒Ad-反义KLF4感染HUVECs后可使KLF4表达明显下降(0.44±0.06),与Ad-GFP组(0.61±0.01)和未感染组(0.59±0.01)比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。而Ad-GFP组与未感染组之间差异无统计学意义(P>0.05)。7. Ad-反义KLF4感染HUVECs后,vWF、PAI-1表达随之明显增加(1.17±0.05,0.73±0.01),与感染Ad-GFP组(1.04±0.03,0.67±0.04)相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。IL-1β刺激Ad-反义KLF4感染HUVECs组,vWF、PAI-1表达增加显著(1.90±0.11,0.97±0.02),明显高于单纯炎性刺激组(1.22±0.06,0.86±0.04)(P<0.05)。8.炎性因子IL-1β刺激内皮细胞KLF4乙酰化水平增加。结论1.炎性因子增强内皮细胞中KLF4表达。2. IL-1β、TNF-α刺激内皮细胞vWF、PAI-1表达。3.抑制KLF4表达后,炎性因子诱导vWF、PAI-1表达增强,内皮细胞的促栓作用增强。4. KLF4具有抑栓作用,KLF4乙酰化可能是其机制之一。5. KLF4可能是内皮细胞抗栓作用的转录调节因子。