藻类是水体生态系统中重要的初级生产者。藻类通过光合作用固定CO2,可为其他生物如生活在藻际环境中的异养细菌等提供碳源等营养物质。同时藻际中的细菌可产生有益或有害物质作用于藻类,致使发生形式不同的菌藻相互作用。这些相互作用不仅影响了两者的生存能力和生理状态,也对水体生态环境产生重要影响,其形式与机制值得深入研究。在常见的菌藻互作关系研究中,研究者常集中于探索单一种类的藻类与一种细菌之间的相互作用。然而,自然条件下往往是多个物种共存,发生着复杂的多物种相互作用,至今我们对菌藻多物种之间的关系了解依然不多。因此,建立菌藻多物种相互作用研究体系对加深复杂种间关系的认识具有重要意义。在本研究中,我们选用了莱茵衣藻这种真核模式藻类与两种不同的细菌同时共培养,探索了种间关系在响应不同温度、碳源时的作用形式和规律。本研究初步搭建了一种研究细菌与藻类多物种相互作用的人工体系,为深入探索复杂微生物种间关系的作用与机制提供了新的基础。本研究主要内容如下:1:莱茵衣藻相互作用细菌的富集与筛选。将环境样品与莱茵衣藻21gr共培养后,富集并分离纯化细菌。将莱茵衣藻分别与不同细菌共接种,在常温与高温条件下通过观察衣藻生长情况,得到高温下加速衣藻死亡(K类)和高温下促进衣藻耐热(P类)的细菌种类。将这些菌株进行16S rRNA基因测序并比对,发现其中两株K类菌属于拟杆菌门(Bacteroidetes),其余菌株均为变形杆菌门(Proteobacteria)。2:莱茵衣藻与单种细菌相互作用。对分离细菌分别与衣藻进行共接种。由于藻类为自养生物,而分离的细菌多为异养型微生物,我们探究了不同碳源条件对上述菌藻互作对藻的影响的规律是否发生变化。结果表明,含乙酸培养基中的实验现象与基本培养基中的结果一致,而另三种碳源条件下的实验现象有不同差异,说明不同碳源对单种菌-衣藻的相互作用有一定影响。3:莱茵衣藻与两种不同细菌的相互作用。为探索藻类如果同时与两株细菌共存时是否会影响藻类对温度的响应,本研究将衣藻21gr同时与上述两种不同K和P类细菌的组合进行共培养并观察现象。结果表明:基本培养基中两种细菌同时存在对21gr在常温条件下的生长趋势无明显影响;高温下约75%的共培养组合中21gr的生长呈现促进耐热的P类表型,约25%的共培养的组合中呈现出加速死亡的K类表型。而乙酸的添加会在少量几个组合(21gr+K9+P9等)的共培养中使衣藻耐热能力发生逆转现象。上述结果表明多物种的培养体系更有益于促进衣藻耐热。4:受碳源影响的三者共培养组合的研究。为研究在上述少数共培养组合中乙酸对衣藻耐热能力的改变是否是由于细菌相对数量的变化而导致,本实验选取21gr+K9+P9组合进行菌、藻细胞数量动态分析。结果表明,不同碳源条件下活细菌的相对数量并不与其实际效果相关,暗示上述乙酸的影响可能是通过不依赖于活细菌数量的其他作用方式;此外,K9和P9两株菌均对高温敏感,且存在乙酸时P9对K9的耐热性具有促进作用;常温下乙酸对K9和P9的生长具有明显促进作用。5:部分菌株的基因组分析。选取K9和P9菌株进行生理生化性质测定以及基因组测序分析。结果表明,K9和P9分别与Blastomonas natatoria和Hydrogenophaga sp.的16S rRNA基因序列同源性最高。通过三代基因组测序得到了两株菌的基因组序列和特征,为进一步阐明“藻-细菌-细菌”三者互作关系的机制提供了遗传信息基础。综上所述,本研究通过筛选环境中与莱茵衣藻耐热能力相关的细菌,初步构建了藻类与两种细菌的多物种共培养体系,并对不同温度、碳源条件下菌藻多物种相互作用进行了探究。本实验为深入探索复杂物种关系及其在微生物群落形成中的作用机制提供了新的科学依据。