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[目的]探索日本血吸虫蛋白SjCyPA和SjE16能否作为PAMP激活TLR4/NF-κB信号通路,并通过该通路活化和极化巨噬细胞,为日本血吸虫的致病机制研究提供新的实验依据。[方法]1.构建pET-28a/SjCyPA和pET-28a/SjE16的原核表达质粒,通过大肠杆菌BL21诱导表达,SDS-PAGE鉴定SjCyPA和SjE16蛋白表达水平;采用Ni-NAT柱纯化重组蛋白SjCyPA和SjE16,利用western blot进行验证,BCA法测定纯化蛋白的浓度。2.检测SjCyPA和SjE16是否诱导巨噬细胞极化。培养小鼠巨噬细胞RAW264.7株,分别用不同浓度的SjCyPA（0、1、20、40、60、80μg/m L）和SjE16（0、1、5、10、15、20μg/m L）,刺激巨噬细胞不同时间（0、12、24、36、48h）,利用RT-PCR检测i NOS、Arg1、IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的m RNA表达水平;western blot检测不同浓度SjCyPA和SjE16刺激巨噬细胞的i NOS蛋白表达水平;选用合适的蛋白浓度和刺激时间刺激巨噬细胞,LPS刺激作为阳性对照,PBS刺激作为阴性对照,流式细胞术检测i NOS、CD86、CD206分子。3.检测SjCyPA和SjE16能否激活巨噬细胞的TLR4/NF-κB信号通路。用不同浓度蛋白SjCyPA和SjE16刺激RAW264.7细胞,western blot检测TLR4和My D88蛋白表达水平;选用合适浓度的SjCyPA和SjE16刺激巨噬细胞,western blot检测不同时间点（0、15、30、60、120、180 min）的NF-κB（p65）磷酸化;分别用不同浓度的TLR4/My D88抑制剂TAK-242（0.1、1、10μM）和NF-κB抑制剂BAY 11-7082（1、10、20μM）预处理RAW264.7细胞后,加入SjCyPA或SjE16共孵育,设置DMSO对照组、DMSO+SjCyPA和DMSO+SjE16刺激组,western blot检测TLR4和My D88的表达和p65的磷酸化,观察两个抑制剂的抑制效率;用最佳抑制浓度10μM TAK-242预处理巨噬细胞后,加入SjCyPA或SjE16蛋白共孵育,设置DMSO对照组、DMSO+SjCyPA和DMSO+SjE16刺激组,western blot检测p65的磷酸化,分析SjCyPA和SjE16蛋白诱导的p65磷酸化是否通过TLR4介导。4.检测SjCyPA和SjE16能否通过TLR4/NF-κB通路诱导巨噬细胞向M1型极化。用最佳抑制浓度10μM TAK-242和20μM BAY11-7082分别预处理巨噬细胞后,加入SjCyPA或SjE16共孵育,设置DMSO对照组、DMSO+SjCyPA和DMSO+SjE16刺激组,RT-PCR检测i NOS、IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA表达水平,western blot检测i NOS蛋白表达水平,ELISA检测细胞培养上清中IL-1β和TNF-α的表达水平;5.检测SjCyPA和SjE16能否通过TLR4通路诱导巨噬细胞活化。用最佳抑制浓度的TAK-242和BAY 11-7082分别预处理巨噬细胞后,加入SjCyPA或SjE16共孵育,设置LPS阳性对照组、DMSO对照组、DMSO+SjCyPA和DMSO+SjE16刺激组,采用荧光探针DCFH-DA用流式细胞术检测ROS的产生,Griess法检测细胞培养上清中NO的水平。[结果]1.成功构建pET-28a/SjCyPA和pET-28a/SjE16的原核表达质粒,SDS-PAGE结果显示原核表达质粒能表达出18k D的SjCyPA蛋白和16k D的SjE16蛋白,western blot结果显示纯化的重组蛋白能与相应的抗体特异性结合。2.SjCyPA和SjE16诱导巨噬细胞向M1型极化。检测不同浓度SjCyPA和SjE16对巨噬细胞的影响,RT-PCR结果显示,与0μg/m L组比较,SjCyPA（40、60、80μg/m L）和SjE16（15μg/m L和20μg/m L）诱导M1型巨噬细胞相关分子及细胞因子i NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α的m RNA表达水平显著性升高（P＜0.05）,15μg/m L和20μg/m L SjE16诱导IL-10 m RNA表达水平显著性升高（P＜0.05）;western blot结果显示SjCyPA和SjE16诱导i NOS蛋白表达水平较0μg/m L组显著性升高（P＜0.05）。检测SjCyPA和SjE16刺激不同时间对巨噬细胞的影响,RT-PCR检测结果显示,与0h组比较,SjCyPA刺激24、36、48h和SjE16刺激12、24、36、48h的i NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α的m RNA表达水平均显著性升高（P＜0.05）,SjE16诱导IL-10 m RNA表达水平在各时间点均显著性升高（P＜0.05）。流式细胞术检测结果表明,与PBS对照组相比,SjCyPA和SjE16均能诱导M1型巨噬细胞标志分子i NOS和CD86表达显著升高（P＜0.05）,而M2型标志分子CD206表达无显著变化（P＞0.05）。3.SjCyPA和SjE16能激活巨噬细胞中TLR4信号通路。Western blot结果表明,SjCyPA和SjE16能诱导巨噬细胞中TLR4和My D88表达水平显著升高（P＜0.05）,SjCyPA和SjE16能诱导巨噬细胞中NF-κB磷酸化,且在刺激60min和120min时p65磷酸化水平最高。抑制剂TAK-242和BAY 11-7082能显著抑制SjCyPA和SjE16诱导的巨噬细胞中TLR4/My D88表达及NF-κB磷酸化。4.SjCyPA和SjE16可通过TLR4信号通路诱导巨噬细胞向M1型极化。ELISA结果显示,与DMSO对照组相比,SjCyPA和SjE16能显著增加M1型巨噬细胞相关细胞因子IL-1β和TNF-α的表达水平（P＜0.01）;在TLR4通路抑制剂作用下,SjCyPA和SjE16对巨噬细胞极化的影响,RT-PCR、western blot和ELISA结果显示,TAK-242和BAY 11-7082均能显著抑制SjCyPA和SjE16诱导的巨噬细胞中M1型相关分子i NOS、IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA表达、i NOS蛋白的表达及IL-1β、TNF-α蛋白的表达（P＜0.05）。5.SjCyPA和SjE16可通过TLR4信号通路诱导巨噬细胞活化。流式细胞术和Griess法检测结果显示,与DMSO对照组相比,SjCyPA和SjE16能显著诱导巨噬细胞产生ROS和NO（P＜0.05）,且在抑制剂TAK-242和BAY 11-7082作用下,SjCyPA和SjE16诱导的ROS和NO表达水平与DMSO+SjCyPA和DMSO+SjE16刺激组比较显著降低（P＜0.05）。[结论]1.SjCyPA和SjE16能作为PAMP激活TLR4/NF-κB信号通路。2.SjCyPA和SjE16可通过TLR4/NF-κB通路诱导巨噬细胞活化及向M1型极化。