尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator,uPA),简称尿激酶,是一种重要的肿瘤相关丝氨酸蛋白酶,其在大多数肿瘤组织中过量表达。活性的uPA能够直接或间接激活纤溶酶原、基质金属蛋白酶等,进而降解细胞外基质,促进肿瘤细胞的转移。同时,肿瘤表面的uPA也可以激活生长因子,促进肿瘤细胞的增殖。目前,uPA已经被美国临床肿瘤学会和德国乳腺癌学会推荐为乳腺癌和前列腺癌诊断和预后的指标。2017年,uPA抑制剂Mesupron被美国食品药品管理局批准用于胰腺癌的临床治疗。基于课题组前期的工作,我们开发了一系列高效、专一的uPA环状多肽抑制剂,其中,抑制效果最好的多肽对uPA的抑制常数为6.8nM,同时对同类的丝氨酸水解酶未表现出明显的抑制效果。在后续工作中,我们通过多种生物化学和分子生物学手段阐明了多肽抑制剂的抑制机理。其中,通过表面等离子共振技术、等温滴定量热法、酶动力学等方法对多肽与uPA及多种同源蛋白酶之间的相互作用开展了动力学研究。同时,我们解析了抑制剂和重组uPA蛋白复合物的晶体结构,以研究该系列多肽和uPA的具体结合方式。然而,X射线晶体结构并未完全阐明抑制剂的作用机理。因此,我们基于晶体结构通过分子动力学技术模拟了生理环境下多肽与uPA相互作用的动力学过程,在分子水平揭示了多肽抑制剂对uPA的抑制机理。此外,我们在细胞水平通过细胞迁移实验和Transwell侵袭实验进一步验证了该系列多肽抑制剂对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。该系列多肽抑制剂在细胞水平可显著抑制小鼠结肠癌细胞(CT-26G)的侵袭,但是对肿瘤细胞的生长没有显著影响,说明uPA多肽抑制剂对肿瘤转移的抑制作用是通过抑制其对细胞外基质或生物膜的降解来实现的。基于上述分子水平和细胞水平的实验结果,我们建立了动物肿瘤模型来评估uPA多肽抑制剂对肿瘤生长和转移的抑制作用。我们发现:在小鼠皮下接种CT-26G肿瘤细胞模型中,多肽抑制剂显著抑制了肿瘤的生长。同时,在小鼠肿瘤肺转移模型中,通过病理切片、实时荧光定量PCR技术发现:用多肽类抑制剂连续治疗15天可显著降低肿瘤的肺转移率,延长小鼠存活时间。本论文的实验结果表明:我们设计的uPA多肽抑制剂具有媲美单克隆抗体的抑制效力和专一性,可通过调控uPA相关信号通路,有效抑制肿瘤细胞的生长和转移。我们的研究成果不仅证明了多肽抑制剂可作为一种高效抗癌先导药,同时也阐明了多肽抑制剂对uPA的抑制机理,对开发其它丝氨酸蛋白酶抑制剂具有重要意义。