宿主与肠道菌群相互依赖、相互制约,通过长期的相互适应,达成一种动态的微生态平衡,形成了互利共生的关系。这种互利共生关系对于维持宿主健康和生理代谢稳定,特别是肠道内环境的稳态具有重要意义,一般认为这种互利共生关系是宿主与肠道菌群长期协同进化的结果。本论文在前人研究基础上,对比了五种代表性的植食性动物肠道菌群,重点对植食性动物与肠道菌群协同进化关系进行了初步探究。研究构建了羚牛、白唇鹿、豚鹿、蒙古野驴、川金丝猴的肠道菌群图谱,探究肠道菌群与不同进化阶段的宿主动物相互作用与适应的机制;对比分析了同一物种在圈养与野生、不同年龄及不同生理健康状态等条件下的肠道菌群差异,揭示食物、环境、动物生理等内外因素对肠道菌群的影响程度,寻找宿主与肠道菌群联系的关键性因素,进而更好地理解长期驱动协同进化进行的选择压力;进一步通过无菌动物模型对羚牛等五种动物的肠道菌群进行粪移植试验,对比分析宿主先天性免疫系统对不同物种肠道菌群的应答方式,以及不同肠道菌群对宿主生理代谢的影响,对进化过程中肠道菌群早期定植机制以及肠道菌群与宿主互作方式做出探究。具体研究内容与结果如下:1基于高通量测序技术分析植食性动物肠道菌群与宿主协同进化趋势采集成都动物园羚牛(n=13)、白唇鹿(n=15)、豚鹿(n=12)、蒙古野驴(n=14)、川金丝猴(n=37)新鲜粪样,采用基于16S r RNA V4区的Illumina Miseq高通量测序技术对比分析五种珍稀动物在动物园圈养条件下的肠道菌群结构及多样性。结果显示,圈养豚鹿、白唇鹿、羚牛三种反刍动物的肠道菌群较为相似,蒙古野驴作为一种单胃草食动物,对纤维素的消化代谢主要依靠后肠发酵,其肠道菌群结构与三种反刍动物差异较大。虽然硬壁菌门和拟杆菌门也是蒙古野驴最优势的两个细菌门类,但蒙古野驴硬壁菌门的相对数量(总菌群占比40.80%)显著低于豚鹿(59.67%)、白唇鹿(67.36%)和羚牛(60.21%)。蒙古野驴拟杆菌门的相对数量(31.49%)高于豚鹿(22.03%)、白唇鹿(23.17%)和羚牛(28.70%)。较高比例的疣微菌门细菌(15.11%)存在于蒙古野驴的肠道菌群中,而这一门类的细菌在豚鹿、白唇鹿和羚牛的肠道菌群中分别只占1.0%,1.3%和1.8%。相较于三种反刍动物,螺旋体门和纤维杆菌门细菌在蒙古野驴肠道菌群中所占比例较高。金丝猴属于单胃植食性动物,具有反刍动物类似的前肠发酵特征,其肠道菌群结构在门水平上与三种反刍动物相似,但在科属水平上存在显著差异,金丝猴含有极高比例的S24-7科的细菌。Alpha多样性分析,三种反刍动物菌群多样性最高,蒙古野驴次之,金丝猴最低。三种反刍动物比较,体型较大的动物(羚牛和白唇鹿)具有更高的菌群多样性。主坐标分析上,三种反刍动物的肠道菌群聚成一簇与蒙古野驴明显分开,金丝猴也单独聚集成一簇。Bipartite网络分析和聚类分析显示,几种草食动物肠道菌群之间的系统发育关系与宿主之间的进化关系一致。进一步分析三种反刍动物的组间差异OTU发现,随着宿主体型的增大,三种动物主要差异OTU的相对数量呈现递减趋势。PICRUSt基因预测也发现,菌群活性相关基因,特别是菌群代谢相关基因,均符合“羚牛<白唇鹿<豚鹿”的规律。后续粪样挥发性脂肪酸检测结果证实,几种动物挥发性脂肪酸的含量也符合以上规律。上述结果表明,五种植食性动物肠道菌群与宿主存在着较为明显的协同进化趋势。2野生与圈养羚牛肠道菌群结构及多样性研究研究采用16S r RNA的Illumina Miseq高通量测序和聚丙烯酰胺凝胶电泳(DGGE)对比分析了野生羚牛(n=6)与圈养羚牛(n=6)粪样肠道菌群结构及多样性。高通量测序发现,硬壁菌门(57.4%)、拟杆菌门(24.2%)和变形菌门(12.3%)细菌为羚牛肠道菌群中的优势菌群。科属水平上,Ruminococcaceae,Bacteroidaceae,Acinetobacter,Clostridium,Lachnospiraceae,Rikenellaceae,Bacillus,Comamonas以及Spirochaetaceae等科属细菌优势存在。野生与圈养羚牛在菌群组成上存在显著差异,圈养羚牛肠道菌群多样性更高。但DGGE结果显示,野生与圈养羚牛肠道菌群基本结构较为类似。此外,荧光定量PCR用于监测成都动物园三个羚牛个体的主要优势菌群在半年试验周期内的变化规律。结果显示,三个羚牛个体的主要优势菌群数量较为接近并且在试验周期内比较稳定。上述结果表明,食物在决定物种肠道菌群方面起到关键作用。3 16S r RNA高通量测序分析腹泻与健康川金丝猴肠道菌群腹泻常伴随着显著的肠道菌群失调,研究采用Illumina Mi Seq高通量测序对比分析健康(n=37)与腹泻川金丝猴(n=15)肠道菌群。粪样短链挥发性脂肪酸浓度与主要毒力因子的拷贝数分别采用气相色谱和荧光定量PCR检测。结果显示,健康与腹泻金丝猴基本菌群结构相似,但与健康金丝猴相比,腹泻金丝猴菌群组成上发生了显著变化,拟杆菌门细菌减少45%。分析不同年龄段健康金丝猴肠道菌群,发现老年健康个体具有最低相对数量的拟杆菌门细菌。同时LEf Se和CCA鉴定出大量细菌种类在健康与腹泻金丝猴中差异存在,MENAP网络分析显示肠道菌群内各种属间的相互关系及菌群功能构架发生改变。PICRUSt基因预测揭示病原相关基因在腹泻金丝猴肠道菌群中大量存在,糖苷代谢相关基因在健康个体中大量存在,健康个体中营养代谢相关基因的数量与个体消化代谢能力呈正相关。经验证,热稳定性肠毒素在腹泻金丝猴中的拷贝数显著高于健康金丝猴(P<0.05)。健康个体中,成年金丝猴粪样中丁酸与总挥发性脂肪酸浓度显著高于老年个体(P<0.05)。以上结果表明,腹泻会导致肠道菌群特定的变化,病原菌的存在和消化不良可能是金丝猴腹泻的两个主因,而这都与肠道菌群的结构组成与功能息息相关。4粪便移植五种动物肠道菌群对无菌斑马鱼转录组的影响本试验将豚鹿、白唇鹿、羚牛、蒙古野驴和川金丝猴五种动物的肠道菌群粪移植入无菌斑马鱼模型中,采用转录组测序分析了无菌斑马鱼模型在植入不同肠道菌群条件下的转录组图谱差异。基于差异基因的FPKM值为表达水平的层次聚类分析显示,移植豚鹿菌群的斑马鱼与移植白唇鹿菌群的斑马鱼转录组表达图谱最为相似。聚类关系由近到远,接下来依次是移植羚牛菌群的斑马鱼、移植金丝猴菌群的斑马鱼和移植蒙古野驴菌群的斑马鱼,这一关系与几种动物宿主线粒体以及肠道菌群的系统发育关系基本一致。差异基因相对表达水平值的H-cluster聚类分析发现,绝大多数基因的表达量也都符合豚鹿>白唇鹿>羚牛,或豚鹿<白唇鹿<羚牛的线性规律。针对斑马鱼宿主代谢及先天性免疫应答基因的反转录定量PCR显示,和普通饲养的斑马鱼相比,无菌斑马鱼的代谢相关基因和先天性免疫系统相关基因都处于低表达状态。移植不同物种的肠道菌群到无菌斑马鱼模型能在不同程度上刺激和调控相关基因的表达。金丝猴和蒙古野驴菌群对斑马鱼先天性免疫系统及代谢相关基因的激发水平最高。比较豚鹿、白唇鹿、羚牛菌群相关基因的应答水平,豚鹿<白唇鹿<羚牛的线性规律依然存在。上述结果表明无菌斑马鱼在移植五种动物肠道菌群后,其转录组同样能够反映五种动物在系统进化上的关系。这将有助于我们理解在协同进化过程中宿主对肠道菌群的应答方式以及肠道菌群对宿主生理与代谢的影响。