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磷酸钙骨水泥(CPC)具有自固化,可塑形的特性,且水化产物是自然骨的主要无机成分,是一种较理想的骨缺损填充材料。临床在填充骨缺损的同时常需要载入药物局部释放,以治疗骨科疾病或预防感染,达到修复骨缺损和药物治疗的双重目的。CPC因制备过程无需高温加热,利于药物的加入,在填充骨缺损的同时又能保持病灶部分药物浓度,延长药物有效治疗时间,因此CPC是一种良好的骨科药物载体。临床中医常采用中药治疗骨科疾病或促进骨修复。中药骨碎补(GSB)在促进骨愈合方面疗效显著,故本研究拟选取骨碎补作为模型药物,选用CPC作为药物载体,制备载骨碎补CPC,并对其理化性能、体外模拟释放及体内外生物学活性进行研究,旨在评价载骨碎补CPC材料修复骨缺损的效果和临床可行性。
本研究采用D型CPC配方,固相由α-磷酸三钙(α-TCP)、二水磷酸氢钙(DCPD)、羟基磷灰石(HA)和碳酸钙(CaCO3)按58Wt%:25wt%:8.5wt%:8.5wt%的比例混合而成,液相为磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4),固液两相按照0.3mL/g的比例调和而成,采用两种载药方式制备载不同浓度骨碎补的CPC。首先是DCPD载药法,即在湿法合成的DCPD膏体中载入骨碎补,样品标记为CPC-GSB,含不同浓度骨碎补的CPC依次标记为CPC-5wt%GSB、CPC-10wt%GSB和CPC-15wt%GSB;另一种是直接混合法,即将CPC固相粉末与骨碎补直接均匀混合,样品标记为CPC+GSB,含不同浓度骨碎补的CPC依次标记为CPC+5wt%GSB、CP+10wt%GSB和CPC+15wt%GSB。
本研究分别采用Gilmore针、X射线衍射仪(XRD)、红外光谱仪(FFIR)、万能材料试验机、扫描电子显微镜(SEM)和紫外分光光度计(UV-Vis)研究载骨碎补CPC的材料学性能和药物体外模拟释放行为,以未载药的CPC作为空白对照。将载药CPC与MC-3T3成骨细胞进行体外共培养,通过倒置显微镜观察CPC周围细胞的生长形貌,扫描电子显微镜观察细胞在CPC表面的粘附,AlamarBlue法检测药物的载入对细胞增殖的影响,通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性检测与载药CPC共培养的细胞分化能力。建立兔股骨缺损模型,植入圆柱形CPC-GSB材料,以未载药CPC作为空白对照,分别在植入材料后的2周、4周和8周取材进行一般观察、X光片观察和组织学观察,对该材料的体内组织相容性和成骨活性进行系统研究,并初步考察药物在骨愈合过程中产生的影响。
研究发现骨碎补的载入延长了CPC的凝结时间,CPC-GSB和CPC+GSB的初凝和终凝时间均随载药量的增加而延长,且与对照组相比有极显著性差异,CPC-5wt%GSB的凝结时间能满足临床要求;水化24h时两种载药方式均未改变CPC的相成分,但对α-TCP的转化具有一定阻碍作用,CPC各成分逐渐向HA转化;CPC-GSB和CPC+GSB水化24h的微观形貌中出现大量薄片状晶体,结构均较对照组致密;两种载药CPC的力学性能较空白组有显著性提高,抗压强度随载药浓度的增大而提高,CPC—GSB的抗压强度高于对应载药浓度的CPC+GSB。两种载药CPC的药物释放均可分为突释阶段和稳定释放阶段,释放行为符合Higuchi基质扩散释放模型;在药物释放过程中,CPC的相成分逐渐向HA转化,除生成大量.HA外仍残余少量α-TCP,载药量越大残余α-TCP的量越多;药物的载入没有改变CPC中相成分的官能团;释放至第15d时CPC-GSB的晶体呈细针状,而在CPC+GSB中有大量不规则片状结构,均比空白对照组致密;CPC-GSB和CPC+GSB的抗压强度较药物释放前均有显著性提高,且随载药浓度的增大而升高,CPC-GSB较对应载药浓度的CPC+GSB抗压强度高。
成骨细胞与DCPD载药法制备的载骨碎补CPC(CPC-GSB)共培养结果表明,载骨碎补CPC能够促进成骨细胞的增殖,并存在剂量和时间依赖关系,培养至第5d时,CPC-5wt%GSB和CPC-10wt%GSB两组材料培养的细胞增殖非常明显,第7d时细胞增殖减弱:与CPC-5wt%GSB共培养7d的成骨细胞分化能力较好;细胞能够较好地粘附于CPC材料表面,表明该材料体外细胞相容性良好。体内植入实验X光片观察发现,随着时间的延长,材料与骨组织的间隙逐渐模糊,直至最后连接紧密。组织学观察表明,骨缺损修复区周围有新骨生成,成骨细胞活跃,随时间的推移,新骨逐渐成熟,新生骨小梁从缺损边缘向材料内部生长,8周时成熟骨数量明显增多,达到骨性连接,而空白对照组新生骨小梁较少,研究表明CPC中骨碎补的载入能够加快骨修复。
本研究成功研制了载骨碎补CPC材料,其中DCPD载药法制备的CPC-5wt%GSB不仅具有优良的材料学性能,而且在促进成骨细胞的增殖和分化方面作用显著,能达到修复骨缺损和药物治疗的双重效果。