论文部分内容阅读
苦荞(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn)是一种药食同源的作物,苦荞蛋白是苦荞中重要的功能成分。近年来研究表明,苦荞蛋白具有抗氧化、调节血脂和血压等生理活性。本文利用超滤分离和凝胶色谱技术对苦荞蛋白酶解产物进行分离纯化,以制备苦荞活性肽。利用过氧化氢和油酸诱导建立的HepG2细胞氧化应激与脂代谢异常模型,探究苦荞活性肽对肝细胞氧化应激和脂代谢的调节作用,并利用逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术从转录水平初步探究其作用机理,从抗氧化与调节脂代谢两个角度揭示了苦荞活性肽调节血脂的可能作用途径,为进一步开发苦荞蛋白提供理论依据。试验结果如下:(1)以体外抗氧化能力(铁离子还原能力、羟自由基清除能力和ABTS自由基清除能力)为评价表征,采用超滤分离与凝胶色谱分离技术对苦荞蛋白酶解物进行快速、高通量分离,制备苦荞活性肽,并经凝胶排阻色谱(gelpermeation chromatography, GPC)鉴定其分子量分布情况。结果表明,苦荞蛋白酶解分离纯化物中TBPH-Ⅱ抗氧化活性最强,铁离子还原能力、羟自由基清除能力、ABTS自由基清除能力分别达到37.8±4.2 mg TE (等效Trolox质量,Trolox equivalent)/g、77.3±4.1 mg TE/g 和 67.3±5.8 mg TE/g。TBPH-Ⅱ的分子量主要分布在 1 KDa至3 KDa,其中重均分子量为1.29 KDa的多肽占61.41 %。(2)利用过氧化氢建立HepG2细胞氧化应激模型,通过分析不同浓度苦荞活性肽TBPH-Ⅱ对细胞氧化还原状态与抗氧化酶活力变化作用,并利用RT-PCR技术初探其作用机理。结果显示浓度为2.0mg/mL的TBPH-Ⅱ处理后,氧化应激模型细胞内SOD、CAT活力极显著上升33.5%、60.9% (P<0.01); MDA含量、GSSG/T-GSH比值显著下降40.9%、47.4% (P<0.01);过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)与血红素加氧酶-1 (heme oxygenase 1,HO-1)基因表达极显著上调(P<0.01)。结果表明TBPH-Ⅱ可以有效改善过氧化氢诱导的HepG2细胞氧化应激,可能是通过激活PPARα/HO-1信号通路发挥作用的。(3)利用油酸建立HepG2细胞脂代谢异常模型,通过分析不同浓度苦荞TBPH-Ⅱ肽对细胞脂代谢的影响,并利用RT-PCR技术初探其作用机理。结果显示浓度为2.0 mg/mL的TBPH-Ⅱ处理后,脂代谢异常模型细胞内总胆固醇、甘油三酯含量极显著下降24.6%、34.4% (P<0.01),油红O染色显示脂质聚集情况得到改善;ATP 结合盒转运蛋白 A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)基因表达显著上调(P<0.05),轻甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methy1-glutaryl-coenzymeAreductase,HMGCR)基因表达显著下调(P<0.05)。结果表明TBPH-Ⅱ可以有效改善油酸诱导的HepG2细胞脂代谢异常,可能通过促进ABCA1的表达来增强胆固醇外流,并通过抑制HMGCR的表达来降低胆固醇合成,从而调节细胞内胆固醇代谢。综上所述,苦荞活性肽可以有效改善过氧化氢诱导的肝细胞氧化应激,而且还可以调节油酸诱导的肝细胞脂代谢异常。