论文部分内容阅读
背景
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人中最常见的一种急性白血病，多年来，临床上造血干细胞移植和化疗药物联用技术逐渐优化，但患者的疾病死亡率和复发率仍居高不下。AML较差的预后与异常骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)所组成的骨髓微环境密不可分。来源于AML患者的骨髓MSCs增殖减慢且易衰老，分化潜能严重失衡，为AML细胞提供源源不断的生存支持。但是AML来源的异常MSCs究竟是通过何种机制来支持白血病细胞的存活还尚未可知，有待进一步探索。
目的
寻找AML来源MSCs中与异常分化相关的差异表达基因，研究该差异基因对MSCs基质功能的影响，并对其机制进行初步探索，为AML的治疗提供新的思路。方法
(1)应用生物学信息分析AML初诊患者和健康供者来源骨髓MSCs转录组表达中的差异表达基因以及MSCs成脂诱导过程中的差异表达基因;整合两个芯片中共同表达的差异基因并将其定义为在AML来源MSCs中成脂分化相关的差异基因;收集我院于2016年10月至2018年9月收治的32例AML初诊患者和30例健康供者的骨髓标本，分离单个核细胞，贴壁培养得到符合鉴定标准的MSCs用于实验，应用实时定量PCR实验验证目的基因AKR1C1在AML和健康供者来源MSCs中的表达水平;
(2)靶向目的基因AKR1C1构建特异的慢病毒干扰载体，转染MSCs后，用嘌呤霉素筛出稳转的MSCs;利用实时定量PCR和Westernblot实验检测MSCs中AKR1C1mRNA和蛋白水平的干扰效率;
(3)采用MTT法检测AKR1C1下调对MSCs增殖能力的影响;应用油红O和茜素红染色检测AKR1C1下调对MSCs成脂和成骨分化能力的影响;应用实时定量PCR技术检测AKR1C1下调对MSCs中分化标志基因表达水平的影响;
(4)将转染了对照载体或AKR1C1干扰载体的MSCs分别与AML细胞系(HL60、NB4、THP1细胞)和AML原代细胞共培养，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验检测AKR1C1下调对共培养的AML细胞增殖、凋亡和集落形成能力的影响;
(5)向敲降MSCs中补充外源性AKR1C1，利用油红O、茜素红染色判断外源AKR1C1对MSCs成脂成骨分化能力的影响;再利用实时定量PCR技术检测外源性AKR1C1对MSCs中分化标志基因表达水平的影响;补充了外源性AKR1C1的敲降MSCs与HL60、NB4和THP1细胞共培养后，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验分别检测外源性AKR1C1对共培养的AML细胞系增殖、凋亡和集落形成能力的影响;
(6)向HL60、NB4和THP1细胞中补充外源性AKR1C1，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验分别检测外源性AKR1C1对AML细胞系增殖、凋亡和集落形成能力的直接影响;
(7)利用Luminex技术检测AKR1C1下调对MSCs分泌细胞因子的影响;利用实时定量PCR检测AKR1C1下调后MSCs中细胞因子表达水平的变化;向对照组和敲降组MSCs中分别补充细胞因子，再与NB4细胞共培养，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验分别检测补充细胞因子后AKR1C1下调对共培养的NB4细胞增殖、凋亡和集落形成能力的影响;
(8)利用Westernblot技术检测分别与对照组MSCs、敲降组MSCs和补充AKR1C1的敲降组MSCs共培养的AML细胞系中STAT3和ERK1/2通路的激活状态;
结果
(1)从GSE122917中筛选出1836个AML来源MSCs表达的差异基因;从GSE59450中筛选出1590个MSCs成脂过程表达的差异基因;整合两个芯片结果得到AML来源MSCs中成脂分化相关的差异基因共271个，其中上调基因41个，下调基因230个;实时定量PCR显示目的基因AKR1C1在AML来源MSCs中的表达水平显著高于健康供者来源的MSCs;
(2)成功构建GV248-shAKR1C1干扰载体，并建立了稳定干扰AKR1C1的MSCs;实时定量PCR和Westernblot结果显示敲降组MSCs中AKR1C1的mRNA和蛋白表达水平均显著下调;
(3)MTT实验显示AKR1C1下调后MSCs的增殖能力并无明显变化;油红O和茜素红染色显示AKR1C1下调后MSCs的成脂分化能力减弱，成骨分化能力增强;实时定量PCR结果显示AKR1C1下调后MSCs中FABP4和PPARG的mRNA表达水平显著降低，而RUNX2和ALP的mRNA表达水平却显著上升;
(4)敲降组MSCs和对照组MSCs与AML细胞系和原代细胞共培养后，MTT实验显示AKR1C1下调会抑制共培养的AML细胞的增殖能力;流式细胞仪结果显示AKR1C1下调会促进共培养的AML细胞的凋亡;集落形成能力显示AKR1C1下调会减弱共培养的AML细胞的集落形成能力;
(5)向敲降组MSCs中补充AKR1C1后，油红O和茜素红染色结果显示外源性AKR1C1恢复了敲降组MSCs的成脂分化潜能，却同时抑制了其成骨分化潜能;实时定量PCR结果显示，外源性AKR1C1上调了敲降MSCs中FABP4和PPARG的mRNA表达水平，下调了RUNX2和ALP的mRNA表达水平;AML细胞系与外源性AKR1C1处理的敲降MSCs共培养后，MTT、流式细胞仪和集落形成实验结果显示外源性AKR1C1增强了敲降MSCs共培养的AML细胞系的增殖，抑制了其凋亡，同时也促进了其集落形成能力。
(6)MTT、流式细胞仪和集落形成实验结果显示直接向AML细胞系中添加外源性AKR1C1并不会对AML细胞系的增殖、凋亡和集落形成造成明显的影响;
(7)Luminex分析结果显示，下调AKR1C1后MSCs分泌的MCP-1、IL-6、G-CSF、IL-8的水平呈现较为明显的下调趋势;实时定量PCR结果显示，下调AKR1C1后MSCs中MCP-1、IL-6、G-CSF的mRNA表达水平均显著下调;NB4细胞与补充了细胞因子的敲降组和对照组MSCs分别共培养后，MTT、流式细胞仪和集落形成实验结果显示，补充了组合细胞因子后，两组MSCs的增殖、凋亡和集落形成能力差异几乎消失，而单独补充IL-6也可达到类似的效果;
(8)Westernblot结果显示敲降AKR1C1能抑制共培养的AML细胞系中磷酸化STAT3和磷酸化ERK1/2的表达，而外源性AKR1C1能上调敲降MSCs共培养的AML细胞系中磷酸化STAT3和磷酸化ERK1/2的表达;
结论
AKR1C1影响着AML来源MSCs的分化平衡;此外，AKR1C1还可通过改变MSCs分泌的细胞因子，来影响骨髓微环境中AML细胞STAT3和ERK1/2信号通路的激活状态，从而调控MSCs对AML的支持作用，这一研究为AML的治疗提供了新的靶点。
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人中最常见的一种急性白血病，多年来，临床上造血干细胞移植和化疗药物联用技术逐渐优化，但患者的疾病死亡率和复发率仍居高不下。AML较差的预后与异常骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)所组成的骨髓微环境密不可分。来源于AML患者的骨髓MSCs增殖减慢且易衰老，分化潜能严重失衡，为AML细胞提供源源不断的生存支持。但是AML来源的异常MSCs究竟是通过何种机制来支持白血病细胞的存活还尚未可知，有待进一步探索。
目的
寻找AML来源MSCs中与异常分化相关的差异表达基因，研究该差异基因对MSCs基质功能的影响，并对其机制进行初步探索，为AML的治疗提供新的思路。方法
(1)应用生物学信息分析AML初诊患者和健康供者来源骨髓MSCs转录组表达中的差异表达基因以及MSCs成脂诱导过程中的差异表达基因;整合两个芯片中共同表达的差异基因并将其定义为在AML来源MSCs中成脂分化相关的差异基因;收集我院于2016年10月至2018年9月收治的32例AML初诊患者和30例健康供者的骨髓标本，分离单个核细胞，贴壁培养得到符合鉴定标准的MSCs用于实验，应用实时定量PCR实验验证目的基因AKR1C1在AML和健康供者来源MSCs中的表达水平;
(2)靶向目的基因AKR1C1构建特异的慢病毒干扰载体，转染MSCs后，用嘌呤霉素筛出稳转的MSCs;利用实时定量PCR和Westernblot实验检测MSCs中AKR1C1mRNA和蛋白水平的干扰效率;
(3)采用MTT法检测AKR1C1下调对MSCs增殖能力的影响;应用油红O和茜素红染色检测AKR1C1下调对MSCs成脂和成骨分化能力的影响;应用实时定量PCR技术检测AKR1C1下调对MSCs中分化标志基因表达水平的影响;
(4)将转染了对照载体或AKR1C1干扰载体的MSCs分别与AML细胞系(HL60、NB4、THP1细胞)和AML原代细胞共培养，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验检测AKR1C1下调对共培养的AML细胞增殖、凋亡和集落形成能力的影响;
(5)向敲降MSCs中补充外源性AKR1C1，利用油红O、茜素红染色判断外源AKR1C1对MSCs成脂成骨分化能力的影响;再利用实时定量PCR技术检测外源性AKR1C1对MSCs中分化标志基因表达水平的影响;补充了外源性AKR1C1的敲降MSCs与HL60、NB4和THP1细胞共培养后，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验分别检测外源性AKR1C1对共培养的AML细胞系增殖、凋亡和集落形成能力的影响;
(6)向HL60、NB4和THP1细胞中补充外源性AKR1C1，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验分别检测外源性AKR1C1对AML细胞系增殖、凋亡和集落形成能力的直接影响;
(7)利用Luminex技术检测AKR1C1下调对MSCs分泌细胞因子的影响;利用实时定量PCR检测AKR1C1下调后MSCs中细胞因子表达水平的变化;向对照组和敲降组MSCs中分别补充细胞因子，再与NB4细胞共培养，利用MTT、流式细胞仪和集落形成实验分别检测补充细胞因子后AKR1C1下调对共培养的NB4细胞增殖、凋亡和集落形成能力的影响;
(8)利用Westernblot技术检测分别与对照组MSCs、敲降组MSCs和补充AKR1C1的敲降组MSCs共培养的AML细胞系中STAT3和ERK1/2通路的激活状态;
结果
(1)从GSE122917中筛选出1836个AML来源MSCs表达的差异基因;从GSE59450中筛选出1590个MSCs成脂过程表达的差异基因;整合两个芯片结果得到AML来源MSCs中成脂分化相关的差异基因共271个，其中上调基因41个，下调基因230个;实时定量PCR显示目的基因AKR1C1在AML来源MSCs中的表达水平显著高于健康供者来源的MSCs;
(2)成功构建GV248-shAKR1C1干扰载体，并建立了稳定干扰AKR1C1的MSCs;实时定量PCR和Westernblot结果显示敲降组MSCs中AKR1C1的mRNA和蛋白表达水平均显著下调;
(3)MTT实验显示AKR1C1下调后MSCs的增殖能力并无明显变化;油红O和茜素红染色显示AKR1C1下调后MSCs的成脂分化能力减弱，成骨分化能力增强;实时定量PCR结果显示AKR1C1下调后MSCs中FABP4和PPARG的mRNA表达水平显著降低，而RUNX2和ALP的mRNA表达水平却显著上升;
(4)敲降组MSCs和对照组MSCs与AML细胞系和原代细胞共培养后，MTT实验显示AKR1C1下调会抑制共培养的AML细胞的增殖能力;流式细胞仪结果显示AKR1C1下调会促进共培养的AML细胞的凋亡;集落形成能力显示AKR1C1下调会减弱共培养的AML细胞的集落形成能力;
(5)向敲降组MSCs中补充AKR1C1后，油红O和茜素红染色结果显示外源性AKR1C1恢复了敲降组MSCs的成脂分化潜能，却同时抑制了其成骨分化潜能;实时定量PCR结果显示，外源性AKR1C1上调了敲降MSCs中FABP4和PPARG的mRNA表达水平，下调了RUNX2和ALP的mRNA表达水平;AML细胞系与外源性AKR1C1处理的敲降MSCs共培养后，MTT、流式细胞仪和集落形成实验结果显示外源性AKR1C1增强了敲降MSCs共培养的AML细胞系的增殖，抑制了其凋亡，同时也促进了其集落形成能力。
(6)MTT、流式细胞仪和集落形成实验结果显示直接向AML细胞系中添加外源性AKR1C1并不会对AML细胞系的增殖、凋亡和集落形成造成明显的影响;
(7)Luminex分析结果显示，下调AKR1C1后MSCs分泌的MCP-1、IL-6、G-CSF、IL-8的水平呈现较为明显的下调趋势;实时定量PCR结果显示，下调AKR1C1后MSCs中MCP-1、IL-6、G-CSF的mRNA表达水平均显著下调;NB4细胞与补充了细胞因子的敲降组和对照组MSCs分别共培养后，MTT、流式细胞仪和集落形成实验结果显示，补充了组合细胞因子后，两组MSCs的增殖、凋亡和集落形成能力差异几乎消失，而单独补充IL-6也可达到类似的效果;
(8)Westernblot结果显示敲降AKR1C1能抑制共培养的AML细胞系中磷酸化STAT3和磷酸化ERK1/2的表达，而外源性AKR1C1能上调敲降MSCs共培养的AML细胞系中磷酸化STAT3和磷酸化ERK1/2的表达;
结论
AKR1C1影响着AML来源MSCs的分化平衡;此外，AKR1C1还可通过改变MSCs分泌的细胞因子，来影响骨髓微环境中AML细胞STAT3和ERK1/2信号通路的激活状态，从而调控MSCs对AML的支持作用，这一研究为AML的治疗提供了新的靶点。