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黑色素瘤(Melanoma)是由黑色素细胞恶性转化而产生的恶性肿瘤之一,多发生于皮肤。皮肤恶性黑色素瘤多数由正常的痣和色素斑演变形成,其生长速度快,转移性强,死亡率高,其发生的分子机制尚不完全清楚,探究其发病机制对黑色素瘤的机制阐明以及治疗具有重要意义。圆柱瘤基因(Cylindromatosis,CYLD)是一种肿瘤抑制基因,其突变与人类家族性圆柱瘤等肿瘤的发生有着密切的关系。CYLD广泛分布于人体细胞内,是一种与微管结合的去泛素化酶,可以调节蛋白质的泛素化水平,在炎症反应、细胞增殖和迁移等多种生物学过程中发挥作用。我们通过肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库中的皮肤黑色素瘤患者样本数据,分析了CYLD在皮肤黑色素瘤中的表达,发现其在患者中低表达,其表达量与生存时间密切相关,提示CYLD在皮肤恶性黑色素瘤发生中发挥重要作用。然而,CYLD在皮肤黑色素瘤中作用及其分子机制尚不完全清楚,基于此,本论文利用人恶性皮肤黑色素瘤细胞系,探究CYLD在肿瘤细胞增殖前移中的作用及其分子机制。本研究首先提取了肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库中的皮肤黑色素瘤患者样本数据,分析CYLD表达与皮肤黑色素瘤患者生存时间的关系;进一步,在人皮肤黑色素细胞和六种人恶性皮肤黑色素瘤细胞系中进行了蛋白表达验证,从中挑选了2种黑色素瘤细胞系开展功能研究;通过慢病毒感染方法构建过表达CYLD(CYLD OE)、敲低CYLD(CYLD-shRNA)、过表达对照(OE-NC)和敲低对照(shRNA-NC)的稳转黑色素瘤A375细胞系和C8161细胞系,利用EdU和划痕损伤实验分别探究CYLD对黑色素瘤细胞增殖和迁移的影响。为了探究CYLD调控肿瘤细胞增殖和迁移的分子机制,本研究通过免疫沉淀-质谱技术筛选CYLD互作蛋白,进一步利用免疫共沉淀实验进行互作蛋白验证;通过泛素化修饰分析实验验证互作蛋白的泛素化修饰水平,初步探究CYLD抑制皮肤黑色素瘤细胞增殖和迁移的机制。实验结果如下:1.CYLD在人皮肤黑色素瘤组织和皮肤黑色素瘤细胞系中低表达。通过对TCGA数据库SKCM样本数据分析,发现CYLD蛋白在黑色素瘤患者中低表达,且低表达CYLD的患者的生存时间更短。进一步利用免疫印迹实验检测人正常皮肤黑色素细胞(PIG1)和六种人恶性皮肤黑色素瘤细胞(SK-MEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-28、C8161、A375、WM115)CYLD表达水平,结果显示:相比较PIG1细胞,六种人黑色素瘤细胞均低表达CYLD蛋白,提示CYLD蛋白表达与黑色素瘤发生发展密切相关。2.CYLD显著抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移。分别利用慢病毒载体成功构建了CYLD OE、OE-NC、CYLD-shRNA、shRNA-NC的A375和C8161稳转细胞系,利用EdU和划痕损伤实验分析细胞增殖与迁移。EdU实验结果显示,CYLD过表达对黑色素瘤细胞的增殖具有极显著抑制作用(p?0.01),而敲低后显著促进细胞的增殖(p?0.01);细胞划痕实验结果显示,CYLD过表达极显著抑制黑色素瘤细胞的迁移(p?0.01),而敲低后显著促进细胞的迁移能力(p?0.01),表明CYLD显著抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力。3.CYLD抑制黑色素瘤细胞增殖迁移的分子机制为探究CYLD抑制黑色素瘤细胞增殖迁移的分子机制,本研究在人恶性黑色素瘤细胞系中过表达Flag-CYLD,利用免疫沉淀-质谱技术鉴定与CYLD互作的蛋白,经筛选发现,NPM与CYLD可能存在互作。进一步利用分子克隆技术成功构建了Flag-NPM真核表达载体,在293T细胞中过表达Flag-NPM和GFP-CYLD,利用免疫沉淀技术探究两者互作关系,结果显示:CYLD与NPM两者存在相互作用。为了探究CYLD是否调控NPM的泛素化水平,在293T细胞中过表达Flag-NPM、GFP-CYLD和Myc-Ub表达载体,免疫沉淀实验显示:CYLD能够降低NPM的泛素化水平,说明NPM是CYLD的去泛素化底物。进一步,我们分析了人正常黑色素细胞(PIG1)和六种人恶性皮肤黑色素瘤细胞(SK-MEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-28、C8161、A375、WM115)中PD-L1蛋白表达,结果显示:在恶性黑色素瘤细胞中PD-L1高表达。进一步分析显示,CYLD能够调控PD-L1的表达,高表达CYLD可以抑制PD-L1表达,而敲低CYLD后促进PD-L1的表达。结合相关文献与本实验研究结果,我们认为:CYLD在皮肤恶性黑色素瘤中低表达,其通过与NPM互作调控NPM的泛素化水平影响PD-L1的表达,进而影响细胞的增殖与迁移。这些数据为探讨CYLD在皮肤恶性黑色素瘤中的作用及机制提供了数据支持。