近年来，由于油脂价格不断攀升导致的廉价油脂替代负面效应突出：油脂氧化、鱼体脂肪肝、代谢紊乱、鱼肉品质下降、水体环境污染等问题。另外由于鱼体生存环境的特殊性也限制了内源性脂肪酶的作用。因此从生物工程角度来解决这一水产实践问题（让廉价油脂高效化）变得紧迫且可行。由于微生物脂肪酶具有底物特异性、手性选择性、温度稳定性、在碱性条件下的稳定性及较高的催化效率等方面的优势，广泛应用于工业生产中。本研究目的采用低温及高温纯培养策略结合两步特异筛选法并结合发酵液脂肪酶法测定方法，从而特异、快速地筛选出来源于池塘底泥环境的低温或高温产脂肪酶菌株，再通过生物信息学方法克隆脂肪酶基因，进行原核表达，测定相关酶学性质。从池塘底泥环境分离获得五株产低温脂肪酶和四株高温脂肪酶菌株。低温菌主要为Acinetobacter属和Pseudomonas属细菌，高温菌主要是Geobacillus属细菌，测定发酵上清及菌体酶活确定低温菌Acinetobacter sp. G1和高温菌Geobacillus sp. B2的酶活相对较高，以此两个菌开展后续工作。对来源于不动杆菌的碱性脂肪酶氨基酸序列进行比对，比对结果显示序列中存在两个保守区域A-P-D-Y-E-G-L-G-（T/E）； T-K-G-[T/A]-[I/V]-A-[V/L]-A-P-A-S，根据这两个保守区域设计了脂肪酶的简并引物Acinet alkaline F和Acinet alkaline R。再通过TAIL-PCR方法克隆得到了1个碱性脂肪酶基因，由1227个碱基组成，编码406个氨基酸和一个终止密码子，前20个氨基酸为信号肽，与来源于Acinetobacter lwoffii SH145的碱性脂肪酶基因全序列相似性为66%。对来源于Geobacillus sp. B2采用位于保守区脂肪酶的氧阴离子洞和活性位点简并引物获得部分序列与进行全基因组测序的Geobacillus sp. WCH70具有100%相似性，基因全长795bp，编码264个氨基酸和一个终止密码子为GDSL家族脂肪酶。对这两个脂肪酶基因G1和B2，分别在大肠杆菌进行异源表达，菌株诱导后均能够检测到脂肪酶活性，质谱验证为表达的目的蛋白，并对重组酶进行了纯化和酶学性质分析。G1的最适温度为40℃，在水体正常温度20-40℃范围内处理2h，剩余酶活能达到50%以上，50℃处理1h后剩余酶活严重下降，表明该酶热稳定性较差，具有低温脂肪酶的特点。最适反应pH为8.0，具有很好的pH稳定性，对大多数金属离子、机溶剂和去污剂对酶活不敏感，具良好的蛋白酶抗性。底物特异性表明该酶适合降解链长在C8-C12间的脂肪酸。对底物4-硝基苯基辛酸酯（C8）比活为8908U/mg。B2的最适温度为65℃，具有良好的热稳定性，90℃处理2h仍有50%以上的活性，表明为典型的高温脂肪酶。最适反应pH为7.5，具有良好pH稳定性，Zn²⁺、K⁺、Li⁺、Na⁺和β巯基乙醇对B2酶活有激活作用而Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Pb²⁺的抑制效果最明显，剩余酶活均低于30%。该酶对有机溶剂、表面活性剂及蛋白酶均有良好的抗性。B2对中链的脂肪酸酯底物具有较高的活性，4-硝基苯基辛酸酯比活为498U/mg，底物C8的Km=0.26mmol/L, Vmax=149.25μmol/min/mg；对底物C10的Km=0.41mmol/L, Vmax=71.1μmol/min/mg。以上结果证明，从池塘底泥环境采用两步筛选法及发酵液酶活测定可以快速地筛选到高产脂肪酶菌株。获得的脂肪酶G1和B2酶学性质结果表明其具有潜在水产动物酶制剂应用价值。