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论文第一部分构建Nrf2低表达的稳定细胞株,用于Nrf2小分子抑制剂作用机制的研究。采用shRNA-Nrf2转染A549、H460细胞,通过Western blotting、还原型谷胱甘肽(reduced-glutathione,GSH)检测得到Nrf2低表达的稳定细胞株A549-C27、H460-C9和H460-C13。在A549-C27中,小分子抑制剂木犀草素(Luteolin)作用后,GSH无显著性降低,同时对抗癌药物的抗细胞增殖作用无明显增强,而在对照组细胞中Luteolin可显著增强抗癌药物的作用。因此,Nrf2很可能是Luteolin增敏肿瘤细胞的重要靶点。在H460-C9和H460-C13细胞株中,MTS结果表明,抗癌药物奥沙利铂(Oxaliplatin)、阿霉素(Doxorubicin)和博来霉素(Bleomycin)的抗细胞增殖作用明显增强。建立Nrf2低表达的稳定细胞株,不仅可用于耐药性的研究,而且为Nrf2小分子抑制剂的研究提供便捷途径。第二部分,进一步研究奥沙利铂对结肠癌细胞Caco2中Nrf2-ARE信号转导通路的作用及相关机理。奥沙利铂作用后,采用检测荧光素酶活性、Westernblotting、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)等方法分析Nrf2调控的基因AKR1C1、NQO1、HO-1等蛋白质表达及mRNA水平升高;进一步检测GSH合成增加,活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平降低。这些结果表明奥沙利铂可激活Nrf2-ARE信号通路。在此,对其作用机制进行研究:染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)法分析表明,奥沙利铂可增强Nrf2的转录活性;实时荧光定量PCR分析显示,在Keap1过量表达的A549-C1细胞株中,奥沙利铂可诱导HO-1的mRNA水平,这一结果表明,奥沙利铂激活Nrf2需要Keap1参与;Western blotting检测发现奥沙利铂可以诱导MAPK信号通路中ERK的磷酸化进而激活Nrf2,通过检测双荧光素酶活性发现ERK磷酸化抑制剂UO126可以抑制奥沙利铂的诱导作用。本结果不仅为Nrf2-ARE信号通路与肿瘤耐药性研究奠定了基础,也可能对奥沙利铂的临床应用具有指导意义。