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DEAD-box蛋白家族是一个ATP依赖的RNA解旋酶家族,广泛存在于从原核生物的细菌到真核生物的酵母、植物和动物等各类生物中,参与多种RNA代谢过程。DDX4、DDX3y和DDX25是DEAD-box家族中与精子发生相关的基因,在小鼠、人、牛等很多物种中,DDX4、DDX3y和DDX25的缺失或减少会导致不同形式的精子发生障碍,精子发生障碍等生殖缺陷也常伴随着DDX4、DDX3y和DDX25的缺失或表达异常。为探究其与精子发生障碍的关系,本研究中以犏牛为雄性不育模型,采用real-time PCR技术检测了牦牛与犏牛睾丸组织DEAD-box蛋白家族基因(DDX4、 DDX3y和DDX25) mRNA表达水平；采用克隆测序技术获得牦牛DDX4基因编码区序列,采用生物信息学方法分析其基因结构、进化和系统发育；采用克隆测序技术筛选牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因的选择性剪接体并采用real-time PCR技术检测各剪接体mRNA的表达水平；采用克隆测序技术获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢盐测序技术对牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区的甲基化程度进行比较分析。研究结果对探讨DDX4基因与犏牛雄性不育的关系,以及揭示犏牛雄性不育的分子机制均具有一定的意义。主要研究结果如下：1.牦牛和犏牛DDX4、DDX25、DDX3y基因的表达分析DDX4和DDX25基因在减数分裂障碍、雄性不育犏牛睾丸组织中的表达水平极显著低于减数分裂正常的牦牛(P<0.01),与人、小鼠等哺乳动物雄性不育个体睾丸组织中DDX4和DDX25基因的表达模式相同,推测DDX4和DDX25基因在牛精子发生和减数分裂过程中发挥重要作用,且与犏牛雄性不育有一定的关系。牦牛睾丸组织中DDX3y基因mRNA表达水平极显著低于犏牛(P<0.01),推测可能是由于DDX3y基因不同转录本之间的相互作用及转录本与蛋白之间的反馈调节作用造成DDX3y基因mRNA在犏牛睾丸组织中的高表达。2.牦牛、犏牛DDX4基因的克隆、序列分析及进化研究牦牛和犏牛DDX4基因编码区序列全长均为2190bp,核苷酸序列与其它哺乳动物DDX4基因有较高的同源性,牦牛和犏牛之间一致性为99.95%,仅在编码区nt1202处发现1个碱基转换(T1202C),并导致相应氨基酸的改变(Ile401Thr).电子染色体定位发现牛DDX4基因定位于20号染色体上,由17个外显子和16个内含子组成,起始密码子位于第二外显子。哺乳动物DDX4基因系统发育树显示聚类结果与经典分类结果一致。牦牛和犏牛DDX4基因编码一个含有729个氨基酸残基的蛋白,具有DDX4蛋白所有的保守基序(Q、Ⅲ、Ⅳ、GG等)和DEAD-box家族的典型结构域(DEADc、DEXDc),说明牦牛、犏牛DDX4基因与哺乳动物其它物种DDX4基因在进化上是相当保守的,推测其具有与其它哺乳动物DDX4蛋白类似的生物学功能,在精子发生过程中发挥重要作用。3. DDX4选择性剪接体的克隆及表达分析牦牛和犏牛睾丸中发现DDX4基因的3种转录本,一种为全长序列DDX4,另两种为选择性剪接转录本,分别命名DDX4sv1和DDX4sv2。DDX4sv1与正常序列相比缺失完整的第四外显子(78bp)和部分第五外显子3’端序列(72bp)共150个碱基,编码的蛋白缺少50个氨基酸残基；DDX4sv2与正常序列相比缺失完整的第四外显子(78bp),编码的蛋白缺少26个氨基酸残基。两种选择性剪接体均遵循“GT-AG’’的剪接规则,剪接部位位于核心结构域以外的N末端,编码的蛋白包含DEAD-box家族蛋白的核心结构域和所有功能基序,推测DDX4sv1和DDX4sv2仍具有DDX4蛋白的基本生物学功能。DDX4、DDX4sv1和DDX4sv2三种转录本在牦牛睾丸组织中的转录水平为DDX4sv2>DDX4>DDX4sv1,差异不显著；同一转录本在牦牛和犏牛之间比较发现,DDX4基因mRNA在犏牛中的表达水平低于牦牛,差异显著(0.01<P<0.05),DDX4sv1和DDX4sv2基因mRNA在犏牛的表达水平均极显著低于牦牛(P<0.01)。推测DDX4sv1、DDX4sv2的均具有一定生物学意义,其表达水平的变化可能会引起精子发生的异常,并且可能与全长DDX4相互协调共同调控精子发生过程。4.牦牛和犏牛DDX4基因启动子区甲基化程度分析通过克隆测序获得牦牛和犏牛DDX4基因5’侧翼序列1369bp,预测核心启动子区位于-384bp～-134bp(以起始密码子ATG的A为+1),长度为251bp,并含有SPl等甲基化敏感位点；预测CpG岛位于-268bp-12bp,长度为345bp,包含20个CpG岛。DDX4基因预测启动区在牦牛睾丸组织中的甲基化程度为67.0%(134/200),犏牛的为86.5%(173/200),犏牛的甲基化水平极显著高于牦牛(P<0.01),这与犏牛中DDX4基因mRNA的低表达量一致,各CpG位点的甲基化水平在牦牛与犏牛间无显著差异。推测DDX4基因启动子的甲基化可能对其mRNA的表达调控起重要作用,且与犏牛精子发生障碍和雄性不育有一定的关系。