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鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）是威胁和危害水禽养殖产业健康发展的重要病原之一,但其致病机理尚未得到完全阐明。NF-κB分子是动物机体NF-κB信号通路关键分子,在动物多种生物学过程中发挥重要作用,与炎症过程和病毒侵染有关,且NF-κB信号通路的关键调控因子有IL-1β等细胞因子,但有关DEV感染与NF-κB信号通路的关联性,未见研究报道。为此,本研究采用RNAi技术沉默NF-κB1基因,分析NF-κB1基因对DEV增殖影响,以及分析NF-κB信号通路的下游关键调控因子IL-1β的变化,以期为DEV致病机理的揭示提供一些基础依据。1.鸭源IL-1β基因RT-PCR检测方法的建立根据GenBank上鸭源IL-1β基因设计特异性引物,进行PCR扩增得到IL-1β基因片段,回收纯化后连接至pMD19-T载体,转化至大肠杆菌并增菌,提取重组质粒进行鉴定,以重组质粒为模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测并进行特异性、重复性和敏感性检验,结果显示:建立的鸭源IL-1β基因荧光定量PCR方法扩增曲线良好,标准曲线方程y=-3.329x+39.731,扩增效率为99.7%,相关系数为1;该荧光定量PCR方法检测的批内重复变异系数小于2%,批间重复变异系数小于3%;该方法的检测灵敏度达1.74×101copies·μL-1,为普通PCR方法的100倍,熔解曲线无杂峰,说明特异性良好。这些结果表明本研究成功建立了鸭源IL-1β基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。2.DEV感染鸭组织器官IL-1β基因转录变化分析选取40d健康鸭60只,随机分为2组即感染组和正常组,感染组肌肉接种DEV而正常组注射生理盐水,于处理后第12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h时捕杀实验鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠、气管、肌肉、法氏囊、胸腺和胰腺,提取组织DNA和mRNA样本,以实验室前期建立的DEV NP基因普通PCR方法进行DEV鉴定,以上述RT-PCR方法进行IL-1β1基因的转录水平检测。结果显示:感染组鸭组织器官均检测到DEV NP基因正常组均未检出,说明DEV感染成功;感染组鸭组织器官IL-1β基因转录水平不同时段上升且高于正常组,其中72h时肺脏、脾脏和肾脏IL-1β转录水平上调幅度最大,达正常组100倍以上。这些结果表明,DEV感染能显著上调IL-1β转录水平。3.靶向NF-kB1基因RNAi对DEV增殖及主要细胞因子分泌的影响取本实验室前期构建的重组质粒pGPU6/GFP/Neo-NF-kB1-14,转染DEF细胞进行沉默效果分析并检测重组质粒对细胞增殖的影响;将病毒感染与质粒转染以三种方法处理DEF细胞细胞,即先接毒24h后转染质粒、先转染质粒24h后接毒和同时进行接毒及质粒转染,于处理后第36h、48h、60h和72h时观察转染荧光情况;同时采用RT-PCR方法检测DEV-NP基因及IL-1β基因转录水平,ELISA方法检测NF-κB信号通路下游因子IL-1β、myD88、TNFα、IL-6和IL-8分泌情况,结果显示:重组质粒pGPU6/GFP/Neo-NF-kB1-2干扰效率达78.77%,沉默效果最好;干扰重组质粒对DEF细胞存活的影响不大;在三个处理组中,与DEV实验组比较,先接毒后转染组对DEV增殖影响差异不显著,而先转染后接毒组和同时接毒转染组均对DEV增殖均呈现明显的抑制作用,其中第48h以同时接毒转染组的沉默效果最好,沉默效率达83%,而第72h以先转染后接毒组的沉默效果最好,沉默效率达77%;IL-1β转录水平在DEV感染组呈先上升后下降趋势,在RNAi干扰组呈先降低后升高趋势,而在RNAi干扰+DEV感染组均低于RNAi干扰组和DEV组;在不同处理组中,NF-κB下游因子表达水平在不同时间段呈现出一定的变化,其中IL-1β的表达在先转染后接毒组和同时接毒转染组中变化规律相似,都在干扰重组质粒对照组中36h、48h、60h均低于正常组,在DEV对照组于36h、60h、72h高于正常组,在干扰重组质粒+DEV组呈现先上升后下降的反复变化。这些结果表明,RNA干扰NF-kB1基因,能抑制DEV增殖并影响NF-κB信号调理下游因子的分泌。综上所述,本研究成功建立了鸭源IL-1β基因荧光定量PCR方法;DEV感染可导致宿主细胞IL-1β基因转录水平上调;RNA干扰NF-kB1基因,能抑制DEV的增殖并影响NF-κB信号通路下游因子的分泌。