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美国白蛾(Hyphantria cunea(Drury))属鳞翅目灯蛾科,是世界性检疫害虫,对我国林业和园林绿化造成重大危害。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是美国白蛾生防农药之一,其主要杀虫活性物质杀虫晶体蛋白通过与中肠受体蛋白结合发挥毒性作用。氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是存在于昆虫中肠Bt最重要的受体蛋白之一。为了明确Bt毒蛋白在美国白蛾中肠的特异受体,本试验分别克隆表达了Bt杀虫蛋白基因及美国白蛾中肠APN1基因,以期明确两者间的互作机制。主要结果如下:1.明确了Bt CYZ-4菌株对美国白蛾2龄幼虫的致死及亚致死效应室内试验测定了Bt菌株CYZ-4对美国白蛾2龄幼虫的致死、亚致死效应。其96h LC50为2.57×105孢子/m L,浓度>106孢子/m L处理组美国白蛾均未能化蛹,而<106孢子/m L处理组存活下来幼虫均能化蛹并羽化,且幼虫发育历期随Bt浓度的增加而延长;亚致死浓度Bt处理美国白蛾96h平均校正死亡率均低于20%,幼虫期略有延迟;蛹重均显著高于对照。2.从Bt CYZ-4菌株中克隆,表达cry2Ab33,并制备特异抗体经RFLP-PCR检测,该菌株存在cry2Ab基因,设计cry2Ab全长引物,扩增得到1902bp全长基因序列。Gen Bank登录号KP053646,被国际Btδ-内毒素基因命名委员会命名为cry2Ab33。cry2Ab33基因编码634个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为70.67k Da和8.36。构建重组表达载体p ET30a-2Ab33,转化E.coli BL21,得到高效表达菌株EC2Ab33,纯化蛋白并制备Cry2Ab33的特异抗体。3.成功克隆和表达了美国白蛾中肠apn1基因分离美国白蛾中肠,提取中肠RNA,反转录获得c DNA模板,通过PCR,RACE获得基因片段,用DNAMAN进行序列拼接及NCBI中BLAST相似性比对为APN1类,所获得的编码美国白蛾氨肽酶N全长基因hcapn1,Gen Bank登录号为KP053647,基因全长3181bp,开放阅读框为3000bp,编码1000个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为113.14k Da和4.85;设计去信号肽引物SF&SR,PCR扩增获得hcapn1,构建原核重组表达载体p ET30a-hcapn1,诱导后表达了约110k Da Hc APN1重组蛋白。4.美国白蛾中肠APN1蛋白与三种Cry毒蛋白的Ligand blot分析将Cry2Ab33,Cry1Ac,Cry9Ea6原毒素经Trypsin消化为有活性的蛋白,将大肠杆菌表达的Hc APN1重组蛋白进行SDS-PAGE后,转膜至PVDF,与活性蛋白分别进行体外Ligand blot杂交试验,显示Hc APN1重组蛋白可以与Cry9Ea6结合,而不与Cry2Ab33及Cry1Ac发生特异结合,推测Hc APN1可能为Cry9Ea6中肠受体蛋白,不是Cry2Ab33,Cry1Ac的特异受体。5.明确Hc APN1与Cry9Ea6的结合区为进一步确定Hc APN1蛋白与Cry9Ea6毒蛋白的结合区,设计两对结构域引物F1&R1和F2&R2。克隆并表达蛋白分子量为62k Da,48k Da的Hc APN1G和Hc APN1E,其编码的结构域蛋白分别位于34 Asp~Asp 527和563Leu~Gln925之间,体外结合试验显示只有Hc APN1E与Cry9Ea6结合,说明Cry9Ea6与Hc APN1的结合发生在Hc APN1的第2个结构域,在563Leu~Gln925之间。