论文部分内容阅读
目的： 1．构建c18orf54基因的原核表达质粒，诱导并表达C18orf54重组蛋白，对其进行纯化，制备C18orf54重组蛋白的多克隆抗体。 2．明确C18orf54蛋白在组织及细胞内的表达特征。 3．明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对HepG2细胞的影响。 4．明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对Jurkat细胞的影响。 5．明确C18orf54基因编码蛋白在肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中的表达水平差异。 方法： 1．运用反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)技术，以人的肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞提取的总RNA为模板，合成cDNA，用此cDNA为模板进行体外扩增，得到目的基因c18orf54的全长CDs，克隆至pGEM-T-Easy载体，对其进行双酶切及测序鉴定，正确后将目的基因c18orf54插入原核表达载体pET-32a(+)中，转化入E.coliRL21，并用IPTG诱导表达C18orf54重组蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot技术和生物质谱分析证实C18orf54重组蛋白表达正确。大量诱导C18orf54重组蛋白后，利用亲和层析柱法纯化C180rf54重组蛋白。 2．利用纯化后的C18orf54重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得抗C180rf54重组蛋白的多克隆抗体。以纯化后的C18orf54重组蛋白为抗原，用Western blot方法和ELISA技术对多克隆抗体进行特异性分析和效价检测。 3．利用激光共聚焦技术、Western blot技术，以及免疫组织化学技术来观察C18orf54蛋白在组织及细胞内的表达特征。 4．采用不同浓度的C18orf54重组蛋白(O.1，1，10，100，1000ng/ml)和HepG2细胞共同在37℃孵箱中孵育48小时，利用流式细胞仪技术分析，来明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对HepG2细胞的可能调控作用。 5．采用不同浓度的C18orf54重组蛋白(0.1，1，10，50，100ng/ml)和Jurkat免疫细胞共同在37℃孵箱中孵育48小时，利用流式细胞仪技术分析，明确不同浓度的C18orf54重组蛋白对Jurkat免疫细胞的影响。 6．采用所制备的C18orf54多克隆抗体包被酶标版，采用ELISA技术，分析C18orf54蛋白在肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中的表达水平。 结果: 1．成功构建了c18orf54的原核表达质粒pET-32a(+)-C18orf54，将该质粒转化入EcoliBL2l中，并用IPTG诱导C18orf54重组蛋白的表达，经SDS-PAGE电泳、Western blot及生物质谱分析证实了C18orf54重组蛋白表达正确，对C18orf54重组蛋白进行了大量诱导表达。 2．纯化C18orf54重组蛋白并成功制备了兔抗C18orf54重组蛋白的多克隆抗体。ELISA分析证实该抗体效价>1:1280000，Western blot分析证明该抗体有较好的特异性。 3．利用免疫组织化学技术和Westernblot技术及激光共聚焦技术，证实C18orf54在不同肝脏组织和不同细胞中均有部分表达，在分泌途径中可见该蛋白的GFP融合蛋白部分定位于内质网。 4．利用不同浓度(0.1，1，10，100，1000ng/ml)的C18orf54重组蛋白与HepG2细胞共孵育，用流式细胞仪分析对其细胞周期的影响，发现高浓度C18orf54重组蛋白(>100ng/ml)对HepG2细胞有促进增殖作用。 5．利用不同浓度(0.1，1，10，50，100ng/ml)的C18orf54重组蛋白与Jurkat细胞共孵育，用流式细胞仪分析对其细胞周期的影响，发现C18orf54重组蛋白在该浓度范围内，对Jurkat免疫细胞的细胞周期没有明显作用。 6．ELISA分析结果发现，C18orf54蛋白在肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中均可检测到，肝硬化患者显著高于肝癌患者(p=0.0013)，但与慢性肝炎患者相比，两组统计学无显性差异(p>0.05)。 结论： 1.表达的C180rf54重组蛋白经Western blot技术和生物质谱鉴定正确。 2.免疫实验动物来制备的抗C18orf54重组蛋白的多克隆抗体具有和C18orf54重组蛋白较高的结合活性。 3.免疫组织化学及Western blot结果证实C18orf54在肝炎、肝硬化、肝癌细胞均有表达。 4.高浓度C18orf54重组蛋白(>100ng/ml)体外对HepG2细胞有一定的细胞周期调控作用。 5.在一定的生理浓度范围内(0.1-100ng/ml)C18orf54重组蛋白对Jurkat免疫细胞的增殖没有明显作用。 6.不同人群的C18orf54蛋白ELISA分析表明，肝硬化患者血清中该蛋白水平高于肝癌患者，但与慢性肝炎患者相比，两组无显著性差异。 以上资料提示，C18orf54基因编码的分泌蛋白可能参与了慢性肝病的发病过程。详细的分子生物学机制还有待探讨。