【摘 要】
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目的:前期研究发现哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）中存在自噬,且较正常大鼠ASMCs自噬增强,但机制尚不清楚。已有多种研究证实,CD38/NAADP信号通路可以调控肾小球足细胞及冠状动脉平滑肌细胞自噬,但该通路是否参与调控ASMCs自噬未见报道,因此,本研究探讨CD38/NAADP信号通路对ASMCs自噬的影响及其机制,为治疗哮喘气道重塑提供新的干预靶点。方法:实验分为两个部分,第一部分:首先
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目的:前期研究发现哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）中存在自噬,且较正常大鼠ASMCs自噬增强,但机制尚不清楚。已有多种研究证实,CD38/NAADP信号通路可以调控肾小球足细胞及冠状动脉平滑肌细胞自噬,但该通路是否参与调控ASMCs自噬未见报道,因此,本研究探讨CD38/NAADP信号通路对ASMCs自噬的影响及其机制,为治疗哮喘气道重塑提供新的干预靶点。方法:实验分为两个部分,第一部分:首先研究不同浓度梯度CD38抑制剂Nico对气道平滑肌细胞自噬的影响及其最适浓度的选择。分离、培养并鉴定大鼠ASMCs,Nico按0、5、10、15、20、25（m M）浓度分组,Western blotting法检测各组细胞中LC3-II表达水平。进一步研究抑制CD38对ASMCs自噬的影响及其机制。实验分组:空白组、Nico组。培养24h后收集各组细胞进行以下实验:（1）Western blotting法检测各组细胞中自噬标志物LC3-II及p62蛋白及自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5-Atg12、Atg7表达水平;（2）q RT-PCR检测各组细胞中自噬相关基因Beclin-1、Atg5、Atg12、Atg7 m RNA表达情况;（3）流式细胞仪检测各组细胞自噬小体（APs）的变化情况;（4）免疫荧光检测各组细胞中p62表达。第二部分:首先研究不同浓度CD38抑制剂对气道平滑肌细胞中NAADP表达的影响,以ASMCs为研究对象,Nico按0、5、10、15、20、25（m M）浓度分组,ELISA法检测各组细胞液中NAADP含量。进一步进行CD38/NAADP信号通路参与调控大鼠气道平滑肌细胞自噬的机制研究。实验分组:空白组、PPADS组。培养24h后收集各组细胞进行以下实验:（1）Western blotting法检测各组细胞中自噬标志物LC3-II及p62蛋白及自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5-Atg12、Atg7表达水平;（2）q RT-PCR检测各组细胞中自噬相关基因Beclin-1、Atg5、Atg12、Atg7 m RNA表达情况;（3）流式细胞仪检测各组细胞自噬小体（APs）的变化情况;（4）流式细胞仪检测各组细胞自噬溶酶体（APLs）的变化情况;（5）免疫荧光检测各组细胞中p62表达。结果:第一部分（一）:Nico 15m M组LC3-II表达显著高于10m M组（p<0.001）,且15、20、25m M组间LC3-II蛋白表达无明显差异（P>0.05）,Nico浓度为15m M时对气道平滑肌细胞自噬影响最大;（二）（1）Nico组LC3-II/LC3-I及p62蛋白表达量较空白组均明显升高（p<0.05）;（2）流式细胞仪检测发现Nico组较空白组自噬小体数量增加（p<0.05）;（3）Western Blotting及q RT-PCR检测发现Nico组Atg5-Atg12蛋白及m RNA表达高于空白组（p<0.05）;（4）Nico组较空白组有明显增强的红色荧光聚集。第二部分（一）:Nico 15m M组NAADP含量显著低于10m M组（p<0.001）,且15、20、25m M组间NAADP含量无明显差异（p>0.05）;（二）（1）PPADS组LC3-II/LC3-I及p62蛋白表达量较空白组均明显升高（p<0.05）;（2）流式细胞仪检测发现PPADS组较空白组自噬小体数量增加（p<0.05）;（3）流式细胞仪检测发现PPADS组较空白组自噬溶酶体数量增加（p<0.05）;（4）Western Blotting及q RT-PCR检测发现PPADS组自噬相关基因表达高于空白组（p<0.05）;（5）Nico组较空白组有明显增强的红色荧光聚集。结论:（1）CD38可能参与大鼠气道平滑肌细胞自噬小体与溶酶体的融合从而调控细胞自噬;（2）NAADP作为CD38下游信号分子参与细胞自噬;（3）CD38/NAADP信号通路可能参与大鼠气道平滑肌细胞中自噬小体与溶酶体的融合从而调控细胞自噬。
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