【摘 要】
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Toll样受体是一类参与非特异性免疫反应的重要蛋白质分子,可识别源于病原微生物的保守结构并激活机体免疫系统产生免疫应答,是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。哺乳动物中已有13种TLRs被克隆鉴定,而真骨鱼类经历三次全基因组加倍后,其基因型的多样性及基因功能的复杂性大大增加,鱼类中已有22种TLRs被克隆鉴定,但对它们的功能却不甚了解。TLR22作为鱼类特有受体之一,已在多种鱼类中被克隆鉴定,但其
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Toll样受体是一类参与非特异性免疫反应的重要蛋白质分子,可识别源于病原微生物的保守结构并激活机体免疫系统产生免疫应答,是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。哺乳动物中已有13种TLRs被克隆鉴定,而真骨鱼类经历三次全基因组加倍后,其基因型的多样性及基因功能的复杂性大大增加,鱼类中已有22种TLRs被克隆鉴定,但对它们的功能却不甚了解。TLR22作为鱼类特有受体之一,已在多种鱼类中被克隆鉴定,但其在不同鱼类中的功能存在较大的差异。齐口裂腹鱼作为我国的特种经济鱼类,创造了巨大的经济价值,因此其健康养殖及抗病免疫功能也备受关注。齐口裂腹鱼是否拥有TLR22受体,是否有着与其它鱼类TLR22相似的免疫功能均未见报道。鉴此,我们基于已有的转录组数据,克隆鉴定齐口裂腹鱼TLR22,并进一步探究其生物学功能,完善TLR22信号机制。因此,本试验以齐口裂腹鱼为研究对象,克隆鉴定齐口裂腹鱼TLR22（spTLR22）分子。对spTLR22进行序列结构及蛋白质3D结构分析;并利用qPCR方法探究其组织表达分布情况,以及在嗜水气单胞菌、LPS或Poly（I:C）刺激后在脾脏、头肾组织和头肾白细胞（HKLs）中的mRNA表达水平变化;再利用双荧光素酶报告系统筛选spTLR22下游可能参与的信号通路,紧接着基于共聚焦荧光显微镜分析的亚细胞定位结果探究spTLR22与LPS或Poly（I:C）之间的识别关系;最后在EPC细胞中过表达spTLR22以进一步验证其免疫功能。本研究中,我们从齐口裂腹鱼中克隆鉴定3种TLR22分子,分别命名为spTLR22-1、spTLR22-2和spTLR22-3,其全长编码序列及蛋白大小分别为2481 bp、2805 bp、2868bp和946 aa、934 aa、955 aa。经序列比对、系统发生树构建及蛋白质3D结构分析后发现,spTLR22s均包含LRRs结构域、跨膜域及TIR结构域三种经典结构,且与鲤鱼TLR22s的亲缘关系最近,表明spTLR22s可能与其它鱼类TLR22有着相似的功能,但蛋白质3D结构分析显示三种spTLR22 LRRs结构域的结合位点各不相同,表明spTLR22s之间的功能可能存在差异;qPCR结果显示,spTLR22s广泛表达于各组织中,在鳃、脾脏等免疫相关组织中表达水平最高,而在嗜水气单胞菌、LPS或Poly（I:C）处理后spTLR22-1和spTLR22-3表达水平显著升高,spTLR22-2却无显著应答反应;双荧光素酶检测系统及亚细胞定位结果显示,spTLR22s均表达于细胞内,且均能激活NF-κB信号通路,但只有spTLR22-1和spTLR22-2能激活IFN-β信号通路,有趣的是,在配体结合试验中,仅spTLR22-1和spTLR22-3具备识别Poly（I:C）的能力,且所有spTLR22s均不能直接识别LPS;过表达分析结果显示,spTLR22-1和spTLR22-3均能显著上调抗病毒相关基因（Mx、IFN、ISG15）的表达水平,且下调抗炎因子IL-10的表达水平,而spTLR22-2并无此效应。上述结果表明,spTLR22s之间的功能存在一定的差异,在抗病毒感染过程中,spTLR22-1和spTLR22-3可通过IFN-β信号通路参与抗病毒免疫反应,而spTLR22-2无此效应;在抗细菌感染过程中,spTLR22-1、spTLR22-2和spTLR22-3均可激活NF-κB信号通路,但仅spTLR22-1和spTLR22-3在细菌或LPS感染过程中呈现促炎抗病效应。
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