果蝇刚毛调控基因extramacrochaetae上游顺式调控元件的鉴定

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协同进化表现在生物学不同层面上,在微观上基因表达的协同进化中,顺-反式调控的协同进化已有大量研究,但对同一转录因子结合不同顺式调控元件,多基因调控的协同进化研究甚少。为了研究多基因调控的协同进化,本研究以果蝇背板刚毛作为表型标记进行研究。果蝇粗刚毛(macrochaetae)的发育受原神经基因achaete-scute(ac-sc)的主导,ac-sc基因受到上游基因激活而表达在刚毛生长的部位。在ac-sc的调控网络中,果蝇extramacrochaetae(emc)基因能够抑制sc基因履行正常的功能,进而抑制粗刚毛的形成,因此emc表达在没有刚毛生长的部位。果蝇sc基因的转录能被刚毛调控基因Pannier(pnr)和Iroquoiscomplex(iro-C)激活,但emc基因的转录调控机制尚不清楚,有研究发现在pnr与iro-C突变的果蝇中,emc表达水平变化,鉴于emc和sc基因表达模式的互补性,推测emc也受到pnr与iro-C的调控,emc和sc应答相同的反式调控模式,在刚毛发育中这两个基因的调控将协同进化。  为了验证果蝇emc基因是否也受到pnr与iro-C的调控,本研究主要专注于对emc基因上游顺式调控序列的鉴别和功能研究。鉴于此,本研究设计了一系列实验旨在验证pnr和iro-C基因是否会调控emc的表达,本研究的主要结果如下:  (1)首先通过生物信息学方法分析了黑腹果蝇emc基因上游序列中的GATA、TAAT和ACAnnTGT序列,预测了潜在的Pnr结合位点(GATA)和Iro-C结合位点(TAAT和ACAnnTGT);  (2)分离克隆出果蝇emc基因上游含有GATA、TAAT和ACAnnTGT保守位点的非编码序列,构建emc基因调控序列的荧光素酶报告基因载体,通过转染细胞和检测荧光素酶活性,在体外利用荧光素酶报告基因系统鉴别出emc基因上游2.3 Kb处的顺式调控元件emcE6;  (3)构建emcE6-EGFP报告基因转基因载体,通过显微注射构建得到顺式调控元件emcE6的转基因果蝇,在果蝇体内验证了潜在顺式调控元件emcE6的表达模式和调控活性;  (4) GATA位点突变体的荧光素酶报告基因分析发现emcE6中一个潜在的Pnr结合位点具有调控活性,pnr基因参与emc的转录调控;  (5)对TAAT位点突变体的荧光素酶报告基因分析发现所鉴定的顺式调控元件emcE6中潜在的Iro-C结合位点无调控活性,本研究表明Iro-C转录因子不参与emc的转录调控。  综上所述,本研究试验结果表明在果蝇emc基因上游2.3 Kb处存在一个具有调控活性的顺式调控元件emcE6;erncE6中一个潜在的Pnr结合位点具有调控活性,调控emc的转录:转录因子Iro-C不参与emc的转录调控。本研究在分子水平上研究了果蝇刚毛调控基因emc的转录调控机制,揭示了果蝇DC刚毛发育有关基因emc与sc的调控将协同进化。本研究为进化发育生物学的研究提供了具体的事例,具有一定的理论创新性。
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