第一部分尾加压素Ⅱ及其受体在糖尿病性心肌病中表达改变的实验研究背景尾加压素Ⅱ（UrotensinⅡ，UⅡ）最早发现于硬骨鱼尾部下垂体，是目前已知最强的缩血管活性物质，其效能可达内皮素-1（ET-1）的10余倍。UⅡ在各种属中普遍存在，目前在包括人类等多个物种中都检测出UⅡ的表达。不同物种UⅡ的结构虽有差异，但都有一环形六肽结构，是UⅡ的活性中心，序列为半胱氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-半胱氨酸。从鱼类到人类，该环形活性中心相当保守，提示具有重要的生理功能。UⅡ受体是一种孤立的G蛋白偶联受体，即UT。UⅡ及其受体在全身多组织器官中均有表达，其在心血管组织中的广泛分布为UⅡ参与心血管系统调节提供了基础。除血管张力调节作用外，UⅡ同血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、ET-1等缩血管物质一样，也具有明显的促心脏重构，特别是促心肌纤维化作用。研究发现，血清UⅡ水平在临床心衰患者中明显升高，并在终末期心衰患者心肌组织中呈高表达。动物实验也发现UⅡ及其受体在心梗后心衰及右室肥厚大鼠心肌组织中均呈高表达状态。在体实验发现UⅡ可以增强异丙肾上腺素导致的大鼠心肌纤维化及心肌肥大，而UⅡ受体拮抗剂治疗可以明显减轻心梗后心衰大鼠心肌细胞肥大及间质纤维化，延缓心脏重构，改善心功能，降低死亡率。体外实验也明确证实UⅡ能够增加心脏成纤维细胞胶原合成、促进心肌细胞肥大，而UⅡ受体拮抗剂可以抑制UⅡ诱导的心肌细胞肥大。近年的研究发现UⅡ还具有代谢调节作用，并与糖尿病及其并发症的发生发展密切相关。糖尿病患者血浆、尿液及肾脏组织UⅡ表达明显高于正常人。动物实验证实脑室内注射UⅡ后，血糖水平明显升高，而大鼠胰腺灌注UⅡ，高糖引起的胰岛素释放被抑制。糖尿病大鼠长期口服选择性UⅡ受体拮抗剂，可以改善存活率，增加胰岛素水平，降低血糖、糖基化血红蛋白及血脂水平，还可以增加肾血流量、延缓蛋白尿及肾功能损害的发生。随着糖尿病发病率的逐年上升，其并发症糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）也日益受到人们的重视。DCM的发病机制复杂，涉及代谢紊乱、心肌细胞肥大、心肌纤维化、小血管病变、自主神经功能紊乱和胰岛素抵抗等多个因素，其中心肌细胞肥大及纤维化是DCM时最重要的病理改变之一，但其发生机制尚未完全阐明。综上所述，鉴于糖代谢紊乱和心脏重构是DCM的特征性病理生理改变，而UⅡ同时参与糖代谢调节及心脏重构过程，我们提出UⅡ／UT系统在DCM的发病中可能具有重要作用的假设。因此，本研究拟在DCM动物模型上，观察UⅡ／UT系统在心脏中的表达情况，以期探讨UⅡ在DCM发病中的病理生理学意义。目的1．构建DCM动物模型。2．探讨DCM动物模型心脏重构及心功能改变情况。3．明确DCM时UⅡ／UT系统的表达情况。方法1．DCM动物模型构建雄性Wistar大鼠27只，随机分为2组：对照组12只，DCM组15只。标准大鼠饲料喂养1周后，禁食12h，DCM组大鼠给以腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）65mg／kg，对照组大鼠注射等量柠檬酸钠／柠檬酸缓冲液。糖尿病大鼠成模标准为：连续2次空腹血糖≥16.7mmol／L。未达成模标准者剔除。DCM组大鼠血糖升高后，继续喂养5个月，处死取材。2．超声心动图检测分别于糖尿病建模前、实验末进行常规超声心动图检查，测定如下指标：M型超声心动图测定左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末内径（LVIDd）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）；彩色多普勒超声心动图观察瓣膜返流情况；脉冲及连续多普勒超声心动图测定二尖瓣E波最大速度、A波最大速度、E／A比值、E波减速时间（EDT）、等容舒张时间（IVRT）、主动脉血流最大速度（APV）。根据心动周期，计算校正的EDT’(EDT’=EDT／（心动周期）^1／2)及IVRT’(IVRT’=IVTR／（心动周期）^1／2)。3．心肌组织病理学检查及Masson三色染色动物处死后，进行组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片，常规HE染色，观察心肌细胞形态并拍片；行Masson三色染色，观察胶原分布形态并定量分析心肌组织胶原含量。4．实时定量RT-PCR法检测分别从左室、右室、心房组织提取总RNA，经逆转录反应（RT）得到cDNA，以管家基因β-actin作为参照，通过实时定量RT-PCR技术检测UⅡ和UT的表达。5．免疫组织化学检测取组织切片，进行UⅡ及UT免疫组织化学检测，所用一抗包括UⅡ多克隆抗体（SantaCruz公司，1：100稀释）和UT多克隆抗体（SantaCruz公司，1：200稀释）。6．免疫印迹检测分别取左室、右室及心房组织，提取总蛋白，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印记、DAB或ECL显色等步骤，检测UT的蛋白表达。结果1．实验动物基本情况及血糖检测实验过程中，对照组大鼠精神状态良好，体重增加明显，反应敏捷，毛色白而光泽。DCM组大鼠出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状，体重增加迟缓，精神萎靡，皮毛无光泽，部分出现烂尾、白内障等。整个实验过程中3只大鼠死亡，均为DCM组，死亡原因可能与糖尿病酮症酸中毒、感染或其他相关并发症有关。另有1只大鼠血糖未达成模标准，予以剔除。最终共23只完成实验，其中对照组12只，DCM组11只。注射STZ之前，对照组与DCM组血糖无明显差异（P＞0.05）。注射STZ 1周后，DCM组血糖明显高于对照组（P＜0.01），并持续至实验末。2．超声心动图检测实验初，对照组及DCM组大鼠超声心动图检测各项指标（包括LVIDs、LVIDd、EF、FS、瓣膜返流、E波最大速度、A波最大速度、E／A比值、EDT’、IVRT’及APV）无显著性差异。实验末，DCM组大鼠LVIDs及LVIDd明显增加，房室瓣瓣膜返流发生率明显增加，E波最大速度下降，A波最大速度增快，E／A比值下降，IVRT’延长，FS降低，APV降低，EDT’及EF无显著性差异。3．心肌组织病理学检查及Masson三色染色HE染色：对照组心肌细胞排列整齐，细胞核大小均一，胞浆染色均匀；DCM组心肌细胞排列紊乱，细胞核大小不甚规则。Masson三色染色：心肌细胞染色呈红色，间质胶原呈蓝绿色，红细胞呈橘黄色。对照组心肌胶原组织分布均匀，DCM组心肌横切面可见心肌内胶原组织明显增多，粗大胶原纤维相互连接成网状，排列紊乱，分布不匀，紧密围绕于心肌细胞周围及小血管周围。定量分析显示，左室心肌组织胶原含量在DCM组明显高于对照组（P＜0.01）。4．实时定量RT-PCR法检测与对照组相比，DCM组左室、右室及心房UⅡmRNA表达均明显增高（P＜0.01），且在同组不同心腔间无显著性差异（P＞0.05）；DCM组左室、右室及心房UT mRNA表达也明显增高（P＜0.01），且在同组不同心腔间无显著性差异（P＞0.05）。5．免疫组织化学检测UⅡ：对照组心肌组织内可见少量、分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒，主要定位于心肌细胞及内皮细胞；DCM组心肌细胞胞浆内可见浓密的深棕色颗粒，同时内皮细胞及心脏成纤维细胞亦见明显表达。UT：对照组心肌组织UT表达很弱，仅见少量分布于心肌细胞；DCM组心肌组织可见浓密的深棕色颗粒，定位于心肌细胞、内皮细胞、心脏成纤维细胞及血管平滑肌细胞。6．免疫印迹检测与对照组相比，DCM组左室、右室及心房组织UT蛋白表达均明显增高（P＜0.01），且在同组不同心腔间无显著性差异（P＞0.05）。结论1．通过腹腔注射STZ并喂养5个月，成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型，为DCM发病机制的研究提供了可靠的平台；2．胶原组织沉积、心肌纤维化是DCM时的主要组织病理改变；3．心脏舒张功能异常是DCM时的主要功能改变；4．DCM大鼠心肌组织UⅡ及UT表达增高，提示UⅡ／UT系统可能在DCM的发生发展中发挥重要作用。第二部分尾加压素Ⅱ促进心脏成纤维细胞胶原合成信号转导通路的研究背景尾加压素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是迄今哺乳动物体内已被证实的最强缩血管活性物质。新近发现UⅡ在心血管系统的病理生理调节中发挥重要作用，UⅡ既具备非内皮依赖性的血管收缩作用，又具备内皮依赖性的血管舒张作用，该作用方式和程度取决于种属及解剖部位。此外，UⅡ在分离的人心房肌小梁表现为正性肌力作用，而负荷量UⅡ注射于短尾猴后，却导致严重的循环衰竭。除了上述血管舒缩、正负性变力等短期心血管调节作用外，UⅡ还参与心脏重构等心血管系统的长期调控过程，具有促进心肌细胞肥大及心肌纤维化作用。目前有关UⅡ作用的细胞内信号转导机制研究多集中在血管调控方面。研究报道UⅡ可能通过蛋白激酶C、钙／钙调蛋白／肌球蛋白轻链激酶系统及MAPKs等信号转导分子介导血管收缩调节。UⅡ也可以激活大鼠主动脉外膜L-精氨酸／一氧化氮通路，从而引起血管舒张。但是，UⅡ对心脏重构方面信号转导机制的研究较少。有研究发现UⅡ通过G_αq、Ras途径引起体外培养的心肌细胞发生肥大表型的改变。以后研究揭示给予UⅡ刺激心肌细胞后，可以激活ERK1／2、P38 MAPK、表皮生长因子受体。上述研究多集中于心肌细胞肥大方面，而关于UⅡ促进心脏重构中胶原合成的信号通路，目前未见相关报道。心脏重构，特别是心肌纤维化是DCM的重要病理生理机制，而我们的上一部分工作发现UⅡ及其受体在DCM中表达显著升高，结合UⅡ具有促进心脏重构作用，我们推测UⅡ很可能在以心肌纤维化为重要特征的DCM心脏重构中发挥重要作用。胶原累积是心肌间质纤维化的基础，故本工作拟在体外培养的CFBs上观察UⅡ对胶原合成过程的影响及其细胞内信号通路，以期为DCM心脏重构的预防和治疗提供新靶点。目的1．观察UⅡ在CFBs胶原合成中的作用。2．观察UⅡ对CFBs ERK1／2磷酸化的影响。3．观察UⅡ对CFBs TGF-β1表达的影响。4．探讨UT、ERK1／2、TGF-β1在UⅡ促CFBs胶原合成过程中的可能作用。方法1．CFBs的分离及培养无菌条件下取出Wistar乳鼠心脏，剪碎、胰酶消化、差速贴壁，获取CFBs。生长至亚融合状态，1：2传代，采用2～4代细胞进行实验。2．实验设计1)CFBs给予UⅡ(10^-7mol／L、10^-8mol／L及10^-9mol／L)刺激，部分给予UT受体拮抗剂urantide预处理，测定Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及胶原蛋白表达；2)CFBs给予UⅡ(10^-7mol／L)刺激5～60min，部分给予urantide或ERK1／2拮抗剂PD98059预处理，测定ERK1／2磷酸化改变；3)CFBs给予UⅡ(10^-7mol／L)刺激4～48h，部分给予urantide或ERK1／2阻断剂PD98059预处理，测定TGF-β1mRNA及蛋白表达；4)单独给予PD98059或TGF-β1中和抗体预处理、或两者联合预处理后，UⅡ(10^-7mol／L)刺激CFBs，测定胶原蛋白表达。3．实时定量RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA表达将所收集的细胞提取总RNA，经逆转录反应得到cDNA，以管家基因β-actin作为参照，通过real-time RT-PCR技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA表达。4．Western blot检测p-ERK1／2蛋白表达将所收集的细胞提取总蛋白，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印记、DAB显色等步骤，检测p-ERK1／2的表达。5．ELISA检测TGF-β1表达将所收集的细胞上清进行提取、孵育、酶反应、显色等步骤，测定OD450值，并计算出相应浓度。6．³H-脯氨酸掺入法检测胶原合成将CFBs分组给予不同干预的同时，加入³H-脯氨酸共同孵育48h，经裂解后，用液闪仪测定³H-脯氨酸掺入量。结果1．UⅡ对胶原合成的影响不同浓度UⅡ(10^-9mol／L、10^-8mol／L和10^-7mol／L)刺激CFBs 24h，结果显示UⅡ呈浓度依赖性促进CFBs的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达，其中以10^-7mol／L UⅡ浓度时胶原mRNA表达量最高。不同浓度UⅡ刺激CFBs 48h，结果显示UⅡ呈浓度依赖性促进CFBs ³H-脯氨酸掺入，同样以10^-7mol／L UⅡ作用最明显。给予UⅡ受体拮抗剂urantide预处理，再给予10^-7mol／L UⅡ刺激细胞，与未经urantide预处理组相比，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达及³H-羟脯氨酸掺入量均明显降低（P＜0.01）；与对照组相比，无显著性差异（P＞0.05）。2．UⅡ对ERK1／2磷酸化的影响以10^-7mol／L UⅡ孵育CFBs，可以时间依赖性促进ERK1／2磷酸化，5～10min时达高峰，60min时该作用逐渐降至基础水平。给予urantide或PD98059预处理后，再给予10^-7mol／L UⅡ刺激CFBs 10min，明显抑制p-ERK1／2表达。3．UⅡ对TGF-β1表达的影响用10^-7mol／L UⅡ孵育CFBs，时间依赖性增加TGF-β1 mRNA表达，4h时开始增加，8h时达高峰，48h时逐渐回落至基础水平；TGF-β1蛋白表达亦呈时间依赖性增加，该增加于12h时开始，24～48h时达高峰。使用Urantide或PD98059预处理后，TGF-β1基因及蛋白表达均被明显抑制。4．ERK1／2及TGF-β1抑制剂对UⅡ促进胶原合成的影响单独给予TGF-β1中和抗体，UⅡ诱导的胶原合成增加被抑制约为70％（141±7％vs112±5％）；单独给予PD98059，UⅡ诱导的胶原合成增加约50％（141±7％vs120±6％）被抑制；而两者联合应用，抑制程度达90％（141±7％vs105±5％）。结论1．UⅡ可以浓度依赖性促进CFBs合成胶原。2．UⅡ可以时间依赖性激活CFBs ERK1／2及TGF-β1信号通路。3．在UⅡ诱导的CFBs胶原合成过程中，UT／ERK1／2／TGF-β1信号通路可能发挥重要作用。