实验目的:硫肽类抗生素因为其复杂的化学结构、良好的生物学活性近年来成为研究的热点。本实验以硫肽类抗生素家族的明星分子——硫链丝菌素(thiostrepton,TSR)为研究对象,在TSR前体肽基因中断的TSR突变株的基础上,靶向敲除负责其生物合成的活性单元喹萘啶酸(quinolone acid,QA)合成的基因——tsr T,再通过回补同类的具有更优的生物活性的盐屋霉素(siomycin,SIO)的前体肽,实现具有产SIO能力的突变株的构建。通过微生物菌株发酵喂养化学修饰的QA类似物,获取具有化学位点修饰的新颖SIO类似物,研究其对口腔常见致病菌的抗菌效果。材料与方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建包含敲除tsr T基因所必需所有元件的质粒p WHU1002,随后通过接合转移将其导入TSR突变株SL2051中,筛选成功敲除的目的菌株SL3051。以SL3051为受体菌,通过接合转移回补SIO的前体肽sio H,发酵喂养化学修饰的QA类似物(5’-F-QA)得到新颖的5-F-SIO,并通过核磁等解析出其化学结构。5’-F-SIO和同家族的TSR、5’-F-TSR、SIO一起进行水溶性测试,通过MIC实验检测4个化合物对口腔常见致病菌(变异链球菌、粘放线菌、乳酸杆菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌)的抗菌活性。实验结果:1.在体外构建出CRISPR/Cas9技术敲除tsr T的质粒p WHU1002,并通过两次的接合转移,完成TSR突变菌株SL3052的构建。2.通过化学合成具有修饰的QA类似物(5’-F-QA),在SL3052菌株的发酵喂养实现5’-F-SIO的产出,分离纯化并完成5’-F-SIO的结构鉴定。3.5’-F-SIO与同类的TSR、5’-F-TSR和SIO的水溶性实验显示5’-F-SIO具有更高的水溶性,MIC抑菌实验则表明5’-F-SIO具有更优的抗口腔致病菌的活性。实验结论:本实验从生物合成角度,选取具有优良生物学活性的硫链丝菌素分子——TSR,在突变合成的思想指导下,采用CRISPR/Cas9技术完成TSR突变株SL2051中的tsr T基因敲除,再回补sio H基因后喂养5’-F-QA的发酵发现了之前未被报道过的新颖TSR类似物——5’-F-SIO。后续的水溶性和针对口腔致病菌的抗菌实验均表现出5位氟代修饰的SIO相比母体的SIO等化合物均具有更优的属性提升。本实验将天然产物家族的TSR家族分子引领到口腔微生物领域,为TSR为代表的核糖体肽在口腔医学领域的应用开创新的局面。