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背景自2003年我国部分地区相继先后出现严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)和禽流感(influent virus A- H5N1,H5N1)的流行以来[1],国内外不断有新的不明原因的发热或传染性肺炎局部暴发的报告,其中以肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)感染多见[2,3-5]。研究统计表明肺炎支原体感染占社区获得性肺炎(Community-acquired pneumonia,CAP)的50%。各型流感病毒及军团菌(Legionella pneumophila, L. pneumophila)等也是社区获得性肺炎的常见病原体之一[6,7]。冬春季为呼吸道疾病发病的高峰期,并且在一些拥挤的环境中如疗养院、监狱、巡航的舰船以及新兵营等更易暴发感染[7]。肺炎支原体感染不只是表现为呼吸道感染,也可表现为全身多器官损伤综合征,国内外文献频繁报道肺炎支原体感染引起皮肤、神经系统、泌尿系统、血液系统及心血管系统等重要脏器的严重并发症[8-15]。社区获得性肺炎的暴发流行不仅与环境因素有关,更重要的是缺乏有效的早期诊断手段。而在疫情的早期要鉴别病毒抑或支原体感染亦较困难。针对近来我省某些院校多次出现不明原因疫情爆发的现状,本实验中选取其中几种常见和新型病原体建立早期、特异且快速的实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,实时荧光定量PCR)法,并联合血清学检测法和高通量扩增测序法来明确疫情的病因,同时用于此后疫情的监测。目的建立能特异、快速且有效地检测5种病原体感染的实时荧光定量PCR方法,并从血清学和基因水平探究一起青年学员急性传染性肺炎暴发的病因。研究对象与方法2007年12月-2008年1月期间某学院爆发了一起不明原因发热疫情,其中71例在我科住院治疗,我们在承接疫情诊疗时及时收集到71例患者的急性期和恢复期血清各一份;采用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测血清中的抗常见呼吸道病原体抗体;用已知的5种病原体标准株通过克隆后得到标准曲线,即建成可以用于临床标本的相应实时荧光定量PCR法。提取血清样本中的DNA/RNA,采用实时荧光定量PCR法检测病原体核酸;并用普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)法随机扩增病原体核酸后采用非选择性高通量扩增测序法直接查找病原体核酸,将扩增产物通过Solexa分析系统直接测序分析。结果在71例患者的急性期和恢复期血清中检测到抗肺炎支原体IgM和/或IgG阳性能诊断肺炎支原体感染者16例(22.5%);实时荧光定量PCR检测甲、乙型流感病毒、嗜肺军团菌和支原体核酸均阴性;在非选择性扩增出的582750条带中,未见特征病毒序列出现;与限定物种数据库比对,不存在人流感病毒A型/B型、嗜肺军团菌、肺炎支原体和鼻病毒等呼吸道相关病原体的基因片段。结论本实验得出以下结论:1)血清学检测结果发现肺炎支原体的现症感染者为16例,患病率为22.5%。2)此次分子生物学检测失败可能与以下因素有关:所用检测技术尚不成熟在临床实践中应用有限及收集不当标本。3)呼吸道传染病应在早期及时收集呼吸道分泌物标本。