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黄曲霉毒素 B1(Aflatoxin B1,AFB1)是一类由寄生曲霉(Aspergillusparasiticus,Aparasiticus)和产毒黄曲霉(Aspergillus flavus,A.flavus)等产生的有毒次级代谢产物,具有较强的致癌性和毒性,且结构非常稳定,一般高温加热都不能将其破坏,对人畜的生命安全具有严重的威胁。而在现阶段,无法通过有效的方法保证食品完全不受AFB1的污染,所以,世界上绝大多数国家都制定了食品和饲料中AFB1的最大允许含量,并积极探索快速、高效检测产品中AFB1含量的方法。在众多的检测方法中,采用免疫学原理进行检测的方法由于其成本较低、灵敏度高、操作简单快速等优点而成为研究热点。免疫学检测依赖于高亲和力、高特异性的抗体,由于传统抗体制备过程耗时长、价格昂贵、具有安全隐患等弊端,促使人们大力开发基因工程抗体。作为第三代基因工程抗体之一的单链抗体(Singlechain Fvfragment,ScFv)由于免疫原性低、分子量小、易于改造和表达而受到人们的广泛关注。噬菌体展示抗体库技术具有操作简单,库容量大,筛选通量高等优点,直接从噬菌体抗体库中筛选出有具有较高亲和力的单链抗体,为人们获得高质量抗体提供了强有力的技术支撑。本课题以AFB1为研究对象,从AFB1-BSA免疫小鼠的脾细胞内扩增ScFv基因,将ScFv片段插入pCANTAB5e载体中,应用噬菌体展示技术筛选抗AFB1-ScFv,并对其性质进行分析,研究结果如下。1抗AFB1单链抗体基因文库的构建采用AFB1-BSA完全抗原免疫Balb/c小鼠,免疫5次后,断尾取血分离抗血清,以ELISA法检测抗血清的效价和灵敏度,在第五次免疫后抗血清效价最高达到25600,灵敏度最高为35.5 ng/mL。提取小鼠脾细胞RNA,反转录生成cDNA,利用简并引物分别扩增出小鼠抗体的全套重链可变区和轻链可变区基因片段,采用重叠延伸 PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)连接成完整的ScFv基因。利用SifI和Notl两个酶切位点将ScFv基因与pCANTAB5e载体连接后转化E.coli TGl,构建抗AFB1单链抗体基因文库,根据抗性平板上的转化子数量计算得出ScFv基因文库库容为5×l06 cfu/mL。2抗AFB1 ScFv噬菌体文库的构建、筛选及鉴定使用辅助噬菌体M13KO7感染带有ScFv基因文库的E.coli TG1,培养后离心,沉析上清液,得到初级单链抗体噬菌体库,实验测得库容约为2×l013 pfu/mL。使用抗原AFB1-OVA,对获得的单链抗体噬菌体库进行筛选,经过五轮筛选后,得到了两个呈阳性的单链抗体噬菌体,分别为ScFv-A和ScFv-B,提取质粒后测序得到两个单链抗体的核酸序列。3抗AFB1 ScFv的性质分析根据ScFv核酸序列推导得出氨基酸序列,将氨基酸序列输入SWISS-MODEL服务系统中,通过序列比对得到与ScFv同源性较高的序列。将相似性较高的多肽序列作为模板,利用Discovery Studio(DS)软件模拟得到ScFv-A和ScFv-B蛋白的三维结构。再将其三维结构与抗原AFB1进行分子对接,预测得到ScFv-A中重链可变区33位的Trp和106位的Ser,ScFv-B重链可变区33位的Tyr、52位的Ser、102位的Tyr在与AFB1结合时起关键作用。。构建重组表达载体pET-30a-ScFv-A和pET-30a-ScFv-B,转化菌株E.coli BL21(DE3),纯化表达目的蛋白,利用SDS-PAGE和ELISA对目的蛋白进行性质分析,结果表明,两种单链抗体均可在E.coli BL21中表达出有活性的可溶性蛋白,大小约为30 kDa。采用间接竞争ELISA进行分析,结果表明ScFv-A和ScFv-B的灵敏度分别约为72 μg/mL和60 μg/mL。