一、研究目的磷脂酸(Phosphatidic acid, PA)是一种简单的磷脂,存在于动植物细胞中,是动植物细胞膜、核膜、质体膜的基本成分,是生命的基础物质。PA是细胞内重要的第二信使,在细胞诸多功能中发挥作用。PA由甘油基、脂肪酸基团、磷酸基组成。PA分子为酸性化合物,带负电荷。PA是磷脂酶D(PLD)作用的直接产物,在细胞激活状态下,PA能引起钙离子动员,激活或协同激活细胞内各种酶,如磷酸二酯酶(PDE)、蛋白激酶C(PKC)、还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶等。在此基础上PA产生各种细胞效应。PA可促进细胞有丝分裂、促进细胞内超氧化物的形成、引起肌肉的收缩、促进激素分泌、诱发血小板聚集等作用。PA可应用在食品工业、医药工业、化妆品等方面。分离纯化PA对于深入研究它的代谢机理、生理作用及开发它的应用范围都有着重要的意义。目前,PA的制备主要采用酶法改性、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和溶剂法,TLC制备的量少仅可于实验分析研究,溶剂法和HPLC法制得的PA的纯度不高,酶法改性的条件不易控制,这些极大的限制了PA的研究和应用的范围,PA的分离纯化一直是研究的热点之一。大豆磷脂是应用最为广泛的食用、药用磷脂。因此,本实验以粉末大豆磷脂为原料,对PA的提取纯化、侧链脂肪酸组成及其生理活性进行了研究。二、研究方法及结果本文以粉末大豆磷脂为原料,采用溶剂法,深入探索高纯度PA的提取纯化方法。PA的定性定量分析主要采用了HPLC法、TLC法。PA的侧链脂肪酸成分的分析采用GC-MS法。PA的生理活性主要是研究外源性PA对原代培养的大鼠海马神经细胞中内钙离子浓度的影响。主要研究内容和所得结果如下:1·采用溶剂法提取纯化PA:本实验充分利用溶剂的酸碱性和极性对磷脂溶解性的影响,通过乙醇抽提、甲醇浸提、液液萃取、金属离子沉淀、丙酮洗涤,最终得到PA样品,纯度为98%,本实验提供了一种简单、有效的制备高纯度PA的方法,为中试生产提供理论依据,具有非常重要的经济价值和理论意义。2·检测方法:(1)薄层层析(TLC法):采用自制硅胶薄层板,湿法铺板,以V (氯仿) : V (无水乙醇) : V (三乙胺) :V(水) = 10 :11. 3 :11. 7 :2. 7为展开剂,上行展开10. 5 cm。溴百里香酚蓝染色15秒,得到满意的分离效果,与文献报道相符,可用于PA的定性分析。(2)高效液相色谱法(HPLC法):流动相为正已烷-异丙醇-水(5: 3:0.4,V/V),恒流洗脱,流速为1.5 ml/min,检测波长为210nm,此分析方法分离效果好,与文献报道相符,可用于PA的定性定量分析。3·侧链脂肪酸成分分析:通过GC-MS分析样品侧链脂肪酸的种类,结果显示,纯化样品的侧链脂肪酸成分主要为C18:0和C18:1(n-9)。4·生理活性研究:原代培养的海马神经元,用无钙细胞平衡维持液维持平衡,加入外源性PA和钙离子后,共聚焦镜检,结果显示,PA可显著增加海马神经细胞内的钙离子浓度。三、研究成果的创新点及意义本论文的创新点:采用溶剂法获得了纯度较高的磷脂酸。外源性磷脂酸可促进原代培养的海马神经细胞对外源性钙离子的吸收。意义:以粉末大豆磷脂为原料,深入探索高纯度磷脂酸的纯化方法,为中试生产提供理论依据。四、结论本实验获得一种简单、有效的从粉末大豆磷脂中制取纯度为98%、侧链脂肪酸为C18的磷脂酸的方法,可用于医药、食品等方面。工艺简单、所用试剂价格低廉。外源性磷脂酸可促进原代培养的海马神经细胞对外源性钙离子的吸收。