论文部分内容阅读
第一部分CD26特异性嵌合抗原受体T细胞的构建及特征描述目的:近年来,嵌合抗原受体T细胞（CART）输注疗法取得了巨大突破,成为当前最具前景的免疫治疗方式。与传统的过继性免疫细胞输注疗法相比,CART细胞以MHC非限制性方式特异性杀伤肿瘤细胞,具有更强的特异性及杀伤性。通过前期文献检索发现,TKIs不能清除的慢性髓系白血病（CML）的白血病干细胞（LSCs）特异性表达CD26表面抗原,此外CD26还过表达于多种难治性恶性肿瘤细胞表面,例如T细胞白血病/淋巴瘤及恶性间皮瘤等实体瘤。CD26单克隆抗体用以治疗CD26阳性的恶性肿瘤的一项I期临床试验显现出较好的疾病缓解率和耐受性,而以CD26为靶点的CART研究还尚未见报道。本部分研究拟以CD26为靶点构建新靶点CART细胞,并阐明其生物学特征,用于靶向CML-LSCs或其他CD26阳性肿瘤细胞。方法:通过专利检索获得CD26单克隆抗体YS110的单链可变区（sc Fv）序列,基因合成sc Fv序列并克隆至二代BB.z CAR框,测序验证,然后包被BB.z CD26-CAR慢病毒,通过q PCR测定病毒滴度;通过磁珠分选CD3阳性T细胞,然后通过T细胞激活磁珠激活T细胞;使用Retro Nectin包被细胞培养板后加入定量病毒及细胞悬液转染激活的T细胞;培养并观察BB.z CD26-CART细胞生长状态,流式检测细胞存活情况、CD26表达情况及转染效率L,并将BB.z CD26-CART细胞与自体T细胞共培养,流式检测杀伤毒性。以同样的方法构建以CD28为共刺激结构域的28.z CD26-CART细胞,扩增28.z CD26-CART细胞,并流式检测转染效率、CD26表达、CD4/CD8亚群、记忆细胞亚群等;分别取转染后第7、14、28天的28.z CD26-CART细胞及其相对应的NT细胞共6个样本做基因表达谱测序分析。结果:通过显微镜下观察发现,以4-1BB为共刺激结构域构建的BB.z CD26-CART细胞存活受限;通过流式检测细胞死亡标记PI,发现与阴性对照T细胞相比,BB.z CD26-CART细胞存在大量死亡,且随着培养时间延长死亡增多,同时伴随CD26表达下降;通过BB.z CD26-CART与CFSE标记的自体T细胞的共培养细胞毒实验发现,自体CFSE-T细胞被杀伤。通过显微镜下观察发现,以CD28为共刺激结构域构建的28.z CD26-CART细胞,在转染后的前几天细胞扩增受限但随后细胞增殖能力显著增强;流式检测CAR转染效率为34.24±2.466%,同时CD26-CAR阴性对照T细胞（NCT）及28.z CD26-CART细胞均出现CD26表达下降;与NCT细胞相比,28.z CD26-CART细胞的初始T细胞群减少而中央记忆T细胞、效应及效应记忆细胞群增多;通过28.z CD26-CART与NT细胞的测序结果对比发现,差异基因的KEGG功能富集主要与免疫应答及免疫细胞分化等相关,且颗粒酶途径抑制基因-SERPIN B9及Cathepsin B基因表达上调而穿孔素表达下降。结论:以4-1BB为共刺激结构域的CD26-CART细胞存在严重的“自相残杀”现象;而以CD28为共刺激结构域时细胞存活情况改善,28.z CD26-CART及NCT细胞（无CD3ζ）均表达CAR并伴随CD26下调,说明CD26下调可能是抗原抗体接触后发生的主动“内吞”过程,进而避免自身抗原诱导的过度“自相残杀”;28.z CD26-CART细胞在自身抗原诱导下倾向于向效应及记忆细胞表型转化,免疫应答相关通路激活,而杀伤抑制性相关基因上调,可能参与保护细胞免受自身抗原诱导的损伤。因此,以CD26为靶点并以CD28为共刺激结构域的CART细胞可以成功构建,并且可以体外扩增获取大量28.z CD26-CART细胞。第二部分28.z CD26-CART细胞的体内外功能验证目的:大量研究发现CD26分子为多种恶性肿瘤的肿瘤相关抗原,包括CML-LSCs及T细胞白血病/淋巴瘤等。在第一部分研究中,以CD26为靶点并以CD28为共刺激结构域,通过慢病毒转染方式可获取大量28.z CD26-CART细胞,但其是否具有特异性抗肿瘤能力还未验证;本部分我们拟以间变大细胞淋巴瘤（ALCL）细胞系-Karpas299细胞、CD26过表达的K562细胞及CML患者来源的LSCs为靶细胞,评价28.z CD26-CART细胞的特异性抗肿瘤能力;同时初步评价其对正常组织的潜在脱靶毒性。方法:将K562及Karpas 299细胞标记CFSE后分别与NT细胞或28.z CD26-CART细胞以不同效/靶比共培养18-24h,标记PI,流式检测杀伤效应;通过慢病毒转染构建CD26/GFP过表达的K562稳转细胞株,并通过流式分选获取CD26/GFP双阳的K562细胞,作为靶细胞分别与NT细胞或28.z CD26-CART细胞以不同效/靶比共培养18-24h,标记死活染料（Zombie）,流式检测杀伤效应;通过磁珠分选CML患者的CD34+细胞,分别与NT细胞或28.z CD26-CART细胞以效/靶比1:2共培养24h,标记Zombie,流式检测杀伤效应;通过流式细胞术检测共培养体系中效应细胞的胞内因子TNF-α、IFN-γ表达及脱颗粒反应;通过CBA试剂盒检测共培养体系的上清中Th1/Th2型细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α的水平;通过小动物活体成像技术验证28.z CD26-CART细胞体内抑制Karpas 299肿瘤进展的能力;通过PDX模型验证28.z CD26-CART细胞体内特异性杀伤CML来源的LSCs的能力;通过将28.z CD26-CART细胞与正常供者的血细胞共培养以及将28.z CD26-CART细胞尾静脉至正常Balb/C小鼠,评价28.z CD26-CART细胞的脱靶毒性。结果:与NT细胞相比,28.z CD26-CART细胞能特异性杀伤CD26阳性的Karpas 299细胞、CD26+K562细胞,并随着效/靶比增高杀伤效果增强,而对CD26阴性的K562细胞无杀伤作用,同时杀伤过程伴随28.z CD26-CART细胞的CD107a表达增高,胞内TNF-α、IFN-γ细胞因子表达增高,上清中Th1/Th2型细胞因子表达增高;此外,28.z CD26-CART细胞能特异性杀伤CML患者（包括3例初治患者及3例T315I突变的复诊患者）来源的CD34+CD26+细胞,而对CD34+CD26-细胞无杀伤作用;与NT细胞相比,28.z CD26-CART细胞可以显著抑制Karpas 299细胞在裸鼠皮下成瘤,并能特异性杀伤植入重症免疫缺陷鼠体内的CML患者来源的CD34+CD26+细胞;与NT细胞相比,28.z CD26-CART细胞对正常供者的淋巴细胞群也有部分杀伤作用（最大效/靶比下最大杀伤率小于60%）,而对单核细胞及粒细胞无影响,此外,28.z CD26-CART细胞注射组老鼠的血常规结果中,白细胞降低,其中以淋巴细胞降低为主,但细胞计数仍在正常参考值范围内,而对肝肾功能等无毒副反应,过程中未出现小鼠死亡。结论:28.z CD26-CART细胞具有特异性杀伤Karpas 299细胞、CD26+K562细胞及CML患者来源的CD34+CD26+细胞的能力,但同时也存在对正常T细胞的部分脱靶毒性。因此,以CD26为靶点构建CART细胞有助于清除CD26阳性肿瘤,但在向临床转化前,还必须克服对T细胞的脱靶毒性反应。第三部分CML-LSCs备选新靶点的筛选目的:研究表明CD26为CML-LSCs的特异性表面标记;在前部分研究中,我们以CD26为靶点构建了28.z CD26-CART细胞,并验证了其对CML患者CD34+CD26+细胞的特异性杀伤作用,然而同时发现28.z CD26-CART细胞对激活的T细胞也具有脱靶杀伤效用;为避免潜在的脱靶毒性,我们拟以CD26为标志分选出CML-LSCs细胞（CD34+CD38-CD26+）及HSCs（CD34+CD38-CD26-）等,通过高通量蛋白组学方式,筛选出CML-LSCs细胞的备选新靶点。方法:收集多例CML患者的骨髓标本,通过磁珠分选联合流式分选的方式分选出3组细胞:CD34+CD38-CD26+、CD34+CD38-CD26-及CD34+CD38+细胞,混合各组细胞进行高通量定量蛋白组学测序,然后对蛋白组学中差异蛋白、膜蛋白数据库及GTEX数据库进行综合分析,筛选出:仅在CD34+CD38-CD26+细胞过表达,而在CD34+CD38-CD26-及各种正常细胞中不表达的膜蛋白分子。结果:经过磁珠分选及流式分选,CD34+CD38-CD26+细胞的分选纯度可达90%;通过蛋白组学测序,发现有273个膜蛋白质在CD34+CD38-CD26+细胞表达上调,进一步剔除在30种正常组织中表达水平大于0.5的蛋白分子,剩余11个膜蛋白分子:OR4C12、OR6X1、VAMP7、DSG4、LCT、CHRNB4、IL1RAPL1、GRID2、HS3ST5、ADCY8及GAL3ST2。其中OR6X1、VAMP7、DSG4及LCT在CD34+CD38-CD26+细胞表达上调倍数具有显著性。结论:综合分析高通量蛋白组学差异蛋白、膜蛋白数据库及GTEX数据库,筛选出4个在CML-LSCs细胞中上调的膜蛋白分子:OR6X1、VAMP7、DSG4及LCT,可能为CML-LSCs细胞的潜在靶点。