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表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是ErbB家族成员之一,具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体。据报道在一些对酪氨酸激酶抑制剂敏感的肺癌患者中发现了EGFR基因酪氨酸激酶结构域的突变。一些非小细胞肺癌患者的EGFR基因具有特定的突变,这些突变与临床上肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼敏感有关。EGFR酪氨酸激酶抑制剂成为非小细胞肺癌(NSCLC)靶向治疗的研究重点。本研究拟构建在对酪氨酸激酶抑制剂敏感的非小细胞肺癌患者中常见的几种EGFR突变,并构建其中一种突变体EGFRL858R和萤光素酶(Luciferase)共表达的转基因报告小鼠,这种小鼠可以通过活体动物体内生物萤光成像技术实时地观察肿瘤的发生发展过程,为非小细胞肺癌EGFR靶向治疗提供方便的研究工具。Tet-On Advanced系统是一种在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系。在Tet-On Advanced系统中,外源基因的表达是通过加入诱导剂doxycycline (Dox)来开启的,这使得目的基因的表达可以随Dox浓度的不同而得到严密的控制。Tet-On系统对于外源基因表达的调控是高效且稳定的。它是通过Tet阻遏蛋白(TetR)作用于大肠杆菌Tn10转座子中的四环素操纵子起作用的。TetR在没有诱导剂存在的情况下结合在Tet操纵子(TetO)上阻遏目的基因的表达,在诱导剂存在的条件下TetR与TetO分离,基因表达被启动。为了实现突变型EGFR基因在转基因小鼠肺组织中特异性表达,我们选用肺泡Ⅱ型上皮细胞表面活性蛋白A(SP-A)启动子指导Tet-On系统逆向四环素反式作用因子rtTA的表达。本研究应用PCR技术,从小鼠基因组DNA中扩增出SP-A启动子并克隆入pGEM-T载体进行测序鉴定。用SP-A启动子替换pTet-On载体的CMV启动子,获得pSP-rtTA载体。设计一对搭桥引物,RT-PCR法从人肺癌A549细胞中分段扩增EGFR cDNA,通过搭桥PCR获得人EGFR全长cDNA。用定点突变的方法获得L858R、delE746-A750和delE746-A750/T790M三种EGFR突变型,并分别将其克隆入pTRE-Tight-BI-L载体得到载体pTRE-EL-1、pTRE-EL-2和pTRE-EL-3。用pSP-rtTA质粒转染人小细胞肺癌NCI-H446细胞,通过G418筛选获得表达Tet-On系统调节元件rtTA的阳性细胞H446-SP-rtTA,通过细胞亚克隆后获得21个转pSP-rtTA基因的细胞单克隆。RT-PCR法检测rtTA基因并通过瞬时转染pTRE-Tight-BI-L载体加强力霉素Dox诱导检测萤光素酶活性确认rtTA的表达后,将p TRE-EL-1质粒转染能稳定表达rtTA的单克隆细胞,潮霉素筛选获得能诱导表达EGFRL858R和萤光素酶基因的H446-rtTA-EL-1细胞,通过细胞亚克隆后得到细胞单克隆13个,加Dox诱导后RT-PCR法鉴定EGFR基因和萤光素酶基因的表达。不同浓度强力霉素Dox诱导转基因细胞H446-rtTA-EL-1后,测定萤光素酶活性,同时Western Blot法检测EGFR的表达。结果显示萤光素酶和EGFR基因的表达均与诱导物浓度呈正相关关系。这些结果表明我们建立的四环素诱导表达体系是有效的,可以用于体内研究。将pSP-rtTA经HindⅢ酶切回收2.6 kb片段、纯化后,显微注射到小鼠受精卵雄原核中。共获得465枚注射卵,这些卵分别移植到17只假孕母鼠的输卵管中,其中13只母鼠怀孕,移植成功率为76.47%,小鼠出生总数121只,经基因组DNA的PCR检测,其中15只小鼠为阳性(雄性9只,雌性6只),阳性率为12.40%。将pTRE-EL-1经ScaⅠ酶切线性化、纯化后,显微注射到小鼠受精卵雄原核中,共获得360枚注射卵,这些卵分别移植到12只假孕母鼠的输卵管中,其中10只母鼠怀孕,移植成功率为83.33%,小鼠出生总数94只,经基因组DNA的PCR检测,其中6只小鼠为阳性,阳性率为6.38%。将首建者小鼠分别与野生型C57BL/6J小鼠交配,子代经PCR检测鉴定阳性小鼠。取SP-rtTA小鼠的肺、脑、胃、心、肝、脾、肾等器官RT-PCR法检测rtTA的表达,结果显示转基因小鼠仅在肺部表达rtTA基因,其它器官没有表达。将能够表达rtTA的转基因小鼠大量繁殖,用于下一步杂交。将两种转基因小鼠杂交,子代小鼠中经Dox诱导后,RT-PCR检测到表达EGFR和萤光素酶基因的为阳性双转基因报告小鼠。